Chapitre 2
Matériels & Méthodes
34
B- Mode opératoire :
Exécution des dilutions décimales :
- Dilution du 1/10 : dans un tube à essai contenant 9ml d’eau physiologique, ajouter 1 ml
d’eau à analyser et agiter ;
- Dilution du 1/100 : du tube contant de l’eau physiologique à la dilution 10
-1 , prélever 1 ml et
le verser dans un tube à essai contenant 9ml d’eau physiologique.
Opérer de la même façon jusqu’à la dilution voulue qui est de 10
-4 dans notre étude.
Pour les échantillons prélevés dans la zone 2, nous avons effectué des dilutions jusqu’à 10
-4 ,
en raison de l’importante concentration apparente en bactéries ; pour les échantillons prélevés
dans la zone 1 et 3 nous avons été seulement jusqu’à la dilution 10
-2 .
La recherche des coliformes nécessite deux tests consécutifs (RODIER et al., 2001) :
Le test présomptif : il a été effectué en utilisant le milieu ou bouillon lactosé
au pourpre de bromocrésol (BCPL) double et simple concentration (DC/SC). Après
ensemencement des milieux avec la quantité nécessaire (1ml), nous avons agité
et homogénéisé sans faire pénétrer de l’air dans la cloche, puis nous avons placé
les tubes dans une étuve à 37°C pendant 48 heures. Dans cette phase nous avons utilisé :
- 3 tubes de BCPL/DC avec 10ml d’eau de mer ;
- 3 tubes de BCPL/SC avec 1ml d’eau de mer ;
- 3 tubes de BCPL/SC pour chaque dilution.
- La lecture : Après 48 heures, sont considérés comme positifs, les tubes qui ont viré
au jaune et qui présentent du gaz dans la cloche.
Le test confirmatif ou test de Mac Kenzie (Recherche d’E-coli) : à partir de chaque tube
positif, on repique dans deux nouveaux milieux, le VBL (bouillon lactosé bilié au vert
brillant) et de l’eau peptonée exempte d’indole (EPI). On ensemence 4 à 6 goutes puis
on incube à 44°C pendant 24 heures.
- La lecture : les tubes présentant un trouble du gaz dans la cloche et un anneau rouge
après addition du réactif de Kovacs indiquant la production d’indole, sont considérés
comme positifs et confirment donc la présence d’E-coli.
Nous avons noté le nombre de tubes positifs dans chaque série de dilution et nous nous
sommes rapportés à la table de Mc Grady pour obtenir le nombre de coliformes totaux,
thermotolérants et d’E-coli présents dans 100ml d'eau.
La méthode de dénombrement des coliformes est schématisée dans la figure 2.22
Matériels & Méthodes
34
B- Mode opératoire :
Exécution des dilutions décimales :
- Dilution du 1/10 : dans un tube à essai contenant 9ml d’eau physiologique, ajouter 1 ml
d’eau à analyser et agiter ;
- Dilution du 1/100 : du tube contant de l’eau physiologique à la dilution 10
-1 , prélever 1 ml et
le verser dans un tube à essai contenant 9ml d’eau physiologique.
Opérer de la même façon jusqu’à la dilution voulue qui est de 10
-4 dans notre étude.
Pour les échantillons prélevés dans la zone 2, nous avons effectué des dilutions jusqu’à 10
-4 ,
en raison de l’importante concentration apparente en bactéries ; pour les échantillons prélevés
dans la zone 1 et 3 nous avons été seulement jusqu’à la dilution 10
-2 .
La recherche des coliformes nécessite deux tests consécutifs (RODIER et al., 2001) :
Le test présomptif : il a été effectué en utilisant le milieu ou bouillon lactosé
au pourpre de bromocrésol (BCPL) double et simple concentration (DC/SC). Après
ensemencement des milieux avec la quantité nécessaire (1ml), nous avons agité
et homogénéisé sans faire pénétrer de l’air dans la cloche, puis nous avons placé
les tubes dans une étuve à 37°C pendant 48 heures. Dans cette phase nous avons utilisé :
- 3 tubes de BCPL/DC avec 10ml d’eau de mer ;
- 3 tubes de BCPL/SC avec 1ml d’eau de mer ;
- 3 tubes de BCPL/SC pour chaque dilution.
- La lecture : Après 48 heures, sont considérés comme positifs, les tubes qui ont viré
au jaune et qui présentent du gaz dans la cloche.
Le test confirmatif ou test de Mac Kenzie (Recherche d’E-coli) : à partir de chaque tube
positif, on repique dans deux nouveaux milieux, le VBL (bouillon lactosé bilié au vert
brillant) et de l’eau peptonée exempte d’indole (EPI). On ensemence 4 à 6 goutes puis
on incube à 44°C pendant 24 heures.
- La lecture : les tubes présentant un trouble du gaz dans la cloche et un anneau rouge
après addition du réactif de Kovacs indiquant la production d’indole, sont considérés
comme positifs et confirment donc la présence d’E-coli.
Nous avons noté le nombre de tubes positifs dans chaque série de dilution et nous nous
sommes rapportés à la table de Mc Grady pour obtenir le nombre de coliformes totaux,
thermotolérants et d’E-coli présents dans 100ml d'eau.
La méthode de dénombrement des coliformes est schématisée dans la figure 2.22