Matériels et méthodes
22
L’enrichissement des vibrions est effectué sur milieu Eau Peptonée Alcaline (EPA) 10 fois concentrée
et l’isolement est réalisé sur gélose TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose).
Les colonies présumées vibrions ont été identifiées (coloration de Gram, test de la catalase, test de
l’oxydase et tests biochimiques à l’aide de la galerie API 20 E).
1-Coloration de gram :
Elle est reliée principalement à la différence de structure chimique des parois cellulaires des bactéries
(Dellarras et Bernard. V 2003) in (Laama, 2009).
Le protocole de coloration de gram selon Dellarras(2007) est le suivant :
• Préparer un frottis d’une culture bactérienne pure.
• Recouvrir le frottis de violet de Gentiane ; laisser agir une minute ; rincer à l’eau distillée.
• Verser le Lugol et le laisser agir pendant une minute ; rincer à l’eau distillée.
• Décolorer à l’alcool à 95%, entre 15 et 30 secondes ; rincer à l’eau distillée.
• Recolorer avec la fushine pendant 10 à30 seconde ; rincer à l’eau distillée.
• Sécher au-dessous de la flamme d’un bec benzène.
Avec cette coloration double, les bactéries gram positif apparaissent en violet foncé tandis que les
bactéries gram négatif sont colorées en rose ou en rouge.
2-Test de catalase : La catalase est une enzyme présente chez la plus part des bactéries
aérobies strictes et anaérobies facultatives. Elle permet de détruire des peroxydes formés au cours de
réaction de l’oxydation (Dellarras et Bernard, 2003) in (Laama, 2009).
L’eau oxygénée formée est décomposée en présence de cette enzyme, en eau et en oxygène qui se
dégage.
3-Les galeries Api :
La galerie API est formée de 20 micro-tubes, prête à l’emploi permettant de réaliser 23 test
biochimique (Joy et Reynaud, 2003) in (Laama, 2009).Chaque tubule contient un substrat différent sur
lequel le micro-organisme recherché va réagir. Ils sont remplis d’une suspension bactérienne calibrée
(de densité différente selon la galerie).
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L’enrichissement des vibrions est effectué sur milieu Eau Peptonée Alcaline (EPA) 10 fois concentrée
et l’isolement est réalisé sur gélose TCBS (Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose).
Les colonies présumées vibrions ont été identifiées (coloration de Gram, test de la catalase, test de
l’oxydase et tests biochimiques à l’aide de la galerie API 20 E).
1-Coloration de gram :
Elle est reliée principalement à la différence de structure chimique des parois cellulaires des bactéries
(Dellarras et Bernard. V 2003) in (Laama, 2009).
Le protocole de coloration de gram selon Dellarras(2007) est le suivant :
• Préparer un frottis d’une culture bactérienne pure.
• Recouvrir le frottis de violet de Gentiane ; laisser agir une minute ; rincer à l’eau distillée.
• Verser le Lugol et le laisser agir pendant une minute ; rincer à l’eau distillée.
• Décolorer à l’alcool à 95%, entre 15 et 30 secondes ; rincer à l’eau distillée.
• Recolorer avec la fushine pendant 10 à30 seconde ; rincer à l’eau distillée.
• Sécher au-dessous de la flamme d’un bec benzène.
Avec cette coloration double, les bactéries gram positif apparaissent en violet foncé tandis que les
bactéries gram négatif sont colorées en rose ou en rouge.
2-Test de catalase : La catalase est une enzyme présente chez la plus part des bactéries
aérobies strictes et anaérobies facultatives. Elle permet de détruire des peroxydes formés au cours de
réaction de l’oxydation (Dellarras et Bernard, 2003) in (Laama, 2009).
L’eau oxygénée formée est décomposée en présence de cette enzyme, en eau et en oxygène qui se
dégage.
3-Les galeries Api :
La galerie API est formée de 20 micro-tubes, prête à l’emploi permettant de réaliser 23 test
biochimique (Joy et Reynaud, 2003) in (Laama, 2009).Chaque tubule contient un substrat différent sur
lequel le micro-organisme recherché va réagir. Ils sont remplis d’une suspension bactérienne calibrée
(de densité différente selon la galerie).