Chapitre III
Matériels et méthodes
31
IV.2.3.3.Techniques de caractérisation et d’identification de quelques bactéries
a. Protocole de la coloration de Gram
Un frottis fixé à la chaleur et coloré pendant une minute avec une solution de violet de gentiane, le
frottis coloré est rincé rapidement avec une solution iodo-ioduré de Lugol, et il y est maintenu pendant
une minute. Le frottis est ensuite décoloré avec l’alcool à 95 % pendant quelques secondes jusqu'à
élimination de l’excès du colorant puis rincé immédiatement avec l’eau du robinet. Le frottis est
ensuite traité avec un colorant qui est une solution de Fushine, rincé rapidement au robinet et séché.
Après ce traitement, les cellules Gram négatif apparaissent roses et les cellules Gram positif
apparaissent sous une couleur violette (Singleton et Sainsbury, 1984)
b. Test de la catalase
Cette enzyme catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) qui est produit par
certaines réactions cellulaires et est très toxiques, donc c’est l’une des enzymes chargée d’éponger
l’eau oxygénée par la dismutation (Pelmont, 1993). La réaction catalysée est la suivante :
2H 2 O 2
O 2 + 2H 2 O
Le test de la catalase consiste essentiellement à ajouter du peroxyde d’hydrogène à des bactéries : la
présence de catalase donne lieu à l’apparition de bulles d’oxygène.
c. Test d’oxydase
Ce test est réalisé à l’aide d’une plaque de marque « BD BBL Dryslide » contenant quatre petits carrés
pré-imprégné par un réactif et destiné chacun à tester une colonie bactérienne.
Ecraser, avec une effilure d’une pipette Pasteur, une colonie de germe à étudier sur le petit carré
(disque d’oxydase). S’il y a apparition d’une tache violette au bout de 30 secondes, on pourra conclure
que la bactérie est oxydase (+) et qu’elle possède la cytochrome oxydase, dans le cas contraire la
bactérie est oxydase (-).
dIdentification par la méthode des galeries API
Les galeries API utilisent 20 tests : Etude de la fermentation de divers glucides, recherche directe d'un
enzyme. Chaque microtubule contient un substrat différent sur lequel le micro-organisme considéré va
réagir. Ils sont remplis d'une suspension bactérienne calibrée. Différentes galeries API ont été utilisées
pour l’identification des différents germes à titre d’exemple : API 20 STREP pour les streptocoques et
API 20 E pour les entérobactéries dont les coliformes et salmonelles et qui peut être utilisée pour
l’identification des non entérobactéries (Vibrio, Pseudomonas).
oxydase -
oxydase +
Figure. III.13. catalase positif
Figure. III.14. Test d’oxydase
Matériels et méthodes
31
IV.2.3.3.Techniques de caractérisation et d’identification de quelques bactéries
a. Protocole de la coloration de Gram
Un frottis fixé à la chaleur et coloré pendant une minute avec une solution de violet de gentiane, le
frottis coloré est rincé rapidement avec une solution iodo-ioduré de Lugol, et il y est maintenu pendant
une minute. Le frottis est ensuite décoloré avec l’alcool à 95 % pendant quelques secondes jusqu'à
élimination de l’excès du colorant puis rincé immédiatement avec l’eau du robinet. Le frottis est
ensuite traité avec un colorant qui est une solution de Fushine, rincé rapidement au robinet et séché.
Après ce traitement, les cellules Gram négatif apparaissent roses et les cellules Gram positif
apparaissent sous une couleur violette (Singleton et Sainsbury, 1984)
b. Test de la catalase
Cette enzyme catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) qui est produit par
certaines réactions cellulaires et est très toxiques, donc c’est l’une des enzymes chargée d’éponger
l’eau oxygénée par la dismutation (Pelmont, 1993). La réaction catalysée est la suivante :
2H 2 O 2
O 2 + 2H 2 O
Le test de la catalase consiste essentiellement à ajouter du peroxyde d’hydrogène à des bactéries : la
présence de catalase donne lieu à l’apparition de bulles d’oxygène.
c. Test d’oxydase
Ce test est réalisé à l’aide d’une plaque de marque « BD BBL Dryslide » contenant quatre petits carrés
pré-imprégné par un réactif et destiné chacun à tester une colonie bactérienne.
Ecraser, avec une effilure d’une pipette Pasteur, une colonie de germe à étudier sur le petit carré
(disque d’oxydase). S’il y a apparition d’une tache violette au bout de 30 secondes, on pourra conclure
que la bactérie est oxydase (+) et qu’elle possède la cytochrome oxydase, dans le cas contraire la
bactérie est oxydase (-).
dIdentification par la méthode des galeries API
Les galeries API utilisent 20 tests : Etude de la fermentation de divers glucides, recherche directe d'un
enzyme. Chaque microtubule contient un substrat différent sur lequel le micro-organisme considéré va
réagir. Ils sont remplis d'une suspension bactérienne calibrée. Différentes galeries API ont été utilisées
pour l’identification des différents germes à titre d’exemple : API 20 STREP pour les streptocoques et
API 20 E pour les entérobactéries dont les coliformes et salmonelles et qui peut être utilisée pour
l’identification des non entérobactéries (Vibrio, Pseudomonas).
oxydase -
oxydase +
Figure. III.13. catalase positif
Figure. III.14. Test d’oxydase