Chapitre III : Matériels et Méthodes
ϰϲϲ
• Principe
La fluorescence est un phénomène qui se produit en deux phases :
L’excitation
L’excitation d’une molécule par une radiation électromagnétique ultraviolette est un
phénomène rapide qui se traduit par le transfert d’un électron d’une orbitale liante vers
une orbitale antiliante. La molécule passe ainsi de son état électronique fondamental
vers un état excité. L’ensemble des transitions électroniques constitue le spectre
d’excitation. La radiation ultraviolette de même que la lumière visible possèdent
suffisamment d’énergie pour transférer des électrons vers des orbitales antiliantes créant
ainsi un état électronique excité.
L’émission
Le retour à un état électronique de moindre énergie ou désactivation est relativement
stable. Il fait intervenir un grand nombre de transitions produisant chacune l’émission
d’une radiation dans toutes les directions. L’ensemble des transitions constitue le
spectre d’émission du rayonnement de fluorescence.
L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’échantillon à
condition que cette dernière soit comprise dans la gamme étalon. Cette technique
s’applique en particulier aux molécules possédant des liaisons doubles conjuguées tels
que les hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques.
3.6.1.1.1. Appareillage analytique :
Les hydrocarbures polyaromatiques sont analysés avec un spectrofluomètre HITACHI
650-10 high sensitivity, équipé d’une lampe à xénon et de cellule en quartz de 1
centimètre de trajet optique, polies sur les quatre faces. Un volume minimal de 0.5 ml
d’échantillon est suffisant à l’analyse.
3.6.1.1.2. Etalonnage et gamme étalon
La standardisation de l’appareil nécessite un hydrocarbure de comparaison ou étalon de
référence. Celui préconisé est le chrysène ou 1,2 benzphenanthrène (C 18 H 12 ) :
La gamme étalon se compose de 1 mg de chrysène dissous dans 10 ml d’héxane soit de
10mg/100ml. On obtient une solution mère ou solution initiale. Des volumes de : 200,
400, 600 et 800µl sont prélevés de la solution mère et dilués dans 10ml d’hexane afin
d’obtenir des solutions filles S1, S2, S3 et S4.
Tableau 11 : Concentration des solutions filles en équivalant chrysène.
Etalons
S1
S2
S3
S4
S5
Concentration
(µg/ml)
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
ϰϲϲ
• Principe
La fluorescence est un phénomène qui se produit en deux phases :
L’excitation
L’excitation d’une molécule par une radiation électromagnétique ultraviolette est un
phénomène rapide qui se traduit par le transfert d’un électron d’une orbitale liante vers
une orbitale antiliante. La molécule passe ainsi de son état électronique fondamental
vers un état excité. L’ensemble des transitions électroniques constitue le spectre
d’excitation. La radiation ultraviolette de même que la lumière visible possèdent
suffisamment d’énergie pour transférer des électrons vers des orbitales antiliantes créant
ainsi un état électronique excité.
L’émission
Le retour à un état électronique de moindre énergie ou désactivation est relativement
stable. Il fait intervenir un grand nombre de transitions produisant chacune l’émission
d’une radiation dans toutes les directions. L’ensemble des transitions constitue le
spectre d’émission du rayonnement de fluorescence.
L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’échantillon à
condition que cette dernière soit comprise dans la gamme étalon. Cette technique
s’applique en particulier aux molécules possédant des liaisons doubles conjuguées tels
que les hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques.
3.6.1.1.1. Appareillage analytique :
Les hydrocarbures polyaromatiques sont analysés avec un spectrofluomètre HITACHI
650-10 high sensitivity, équipé d’une lampe à xénon et de cellule en quartz de 1
centimètre de trajet optique, polies sur les quatre faces. Un volume minimal de 0.5 ml
d’échantillon est suffisant à l’analyse.
3.6.1.1.2. Etalonnage et gamme étalon
La standardisation de l’appareil nécessite un hydrocarbure de comparaison ou étalon de
référence. Celui préconisé est le chrysène ou 1,2 benzphenanthrène (C 18 H 12 ) :
La gamme étalon se compose de 1 mg de chrysène dissous dans 10 ml d’héxane soit de
10mg/100ml. On obtient une solution mère ou solution initiale. Des volumes de : 200,
400, 600 et 800µl sont prélevés de la solution mère et dilués dans 10ml d’hexane afin
d’obtenir des solutions filles S1, S2, S3 et S4.
Tableau 11 : Concentration des solutions filles en équivalant chrysène.
Etalons
S1
S2
S3
S4
S5
Concentration
(µg/ml)
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00