Troisième partie : Résultat et discussions
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15.Techniques d’identification bactérienne:
15.1.
Technique de la coloration de Gram :
a) Préparation du frottis :
 poser une goutte d’eau distillée sur une lame propre, prélever un fragment d’une
colonie bactérienne isolée et l’étaler sur la lame,
 sécher en approchant la lame de 15-20 cm au-dessus de la flamme du bec bunsen.
b) Fixation :
 tenir la lame avec une pince et la passer trois fois à la flamme avec la lame. Cette
étape consiste à tuer les bactéries, à rendre les membranes plus perméables, à fixer les
structures sans les altérer et à faire adhérer le frottis à la lame.
c) Coloration de Gram :
 Coloration primaire : couvrir la lame de violet de gentiane et laisser agir 2min. Jeter
l’excès de colorant.
 Mordançage : égoutter sans rincer et faire deux bains de lugol dont chacun dure 45
sec.
 Décoloration : égoutter et plonger la lame dans l’alcool 96
o
durant 30 secondes.
 Rincer doucement et abondamment à l’eau distillée.
 Coloration secondaire : recolorer les germes décolorer avec la fuchsine pendant 2
min.
 Laver à l’eau distillée et sécher la lame au-dessus de la flamme.
d) Observation au microscope :
 Observer à l’objectif à immersion (G 100×10) :
o les bactéries colorées en violet sont les bactéries Gram+,
o les bactéries colorées en rose sont les bactéries Gram-.
15.2.
Recherche de l’oxydase:
L’oxydase ou la Cytochrome oxydase est une enzyme présente dans certaines chaines
respiratoires cytochromiques bactériennes (DELARRAS, 2007).
La recherche d’oxydase consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie testée à
oxyder la forme réduite incolore de dérivés méthylés du paraphénylène diamine, en leur
forme oxydée semi-quinonique rose violacée (PRESCOTT et al, 2010).
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