CHAPITRE II
Matériel et méthodes
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 Principe de la méthode :
Sur le frottis bactérien préparé, le 1
er colorant, le violet de gentiane, va colorer en violet les
bactéries, puis le Lugol (solution iodo-iodurée) libère de l’iode qui va fixer le colorant précédent.
Un complexe iode-cristal violet se forme ; il sera solubilisé par l’alcool à 95° lors de la phase de
décoloration, uniquement pour les bactéries Gram
- .
Le 2
ème colorant, dit de contraste, fuchsine, va colorer en rose les bactéries Gram
-
, les bactéries
Gram
+ , non décolorées par l’alcool, ont conservé leur couleur violette.
 Mode opératoire :
- Au moyen d’une boucle d’inoculation, on dépose un peu d’eau sur une lame en verre propre
de microscope ;
- avec la même boucle, on mélange à cette eau un tout petit peu de matériel prélevé sur une
colonie pour obtenir une suspension de cellules ;
- Toujours avec la même boucle, étaler cette suspension sur une surface d’un ou deux
centimètres carrés et on laisse sécher pour obtenir ce qu’on appelle « un frottis » ;
- Le frottis est ensuite fixé par des passages rapides dans la flamme d’un bec bunsen ;
- Recouvrir le frottis avec du violet de gentiane, laisser agir une minute, rincer avec de l’eau
distillée ;
- Verser du Lugol et laisser agir pendant une minute (généralement on fixe le colorant précédent
avec deux bains du Lugol séparés par 20 secondes) ; rincer à l’eau distillée ;
- Décolorer à l’alcool à 95° pendant 45 secondes ; rincer à l’eau distillée ;
- Recolorer avec de la fuchsine pendant 20 secondes ; rincer à l’eau distillée ;
- Sécher et Observer au microscope à l’huile à immersion au grossissement ×1000.
Figure 12 : Coloration de Gram.
b. Recherche de la catalase :
 Principe :
La catalase est une enzyme présente chez la plupart des bactéries aérobies strictes et
anaérobies facultatives. Elle permet de détruire des peroxydes formés au cours des réactions
Gram
+
Gram
