4.2.2. Techniques de confirmation et d’identification :
4.2.2.1.
La coloration de Gram :
Avant la réalisation de cette coloration, on doit d’abord préparer un frottis :
Déposer une goutte d’eau stérile sur une lame ensuite ajouter une colonie isoler d’une boites
pour créer une suspension bactérienne et à l’aide d’une pipette on fait des étalements. Il faut
obtenir un frottis fixé, cette fixation se fait Par une flamme pendant 10 à 15 secondes.
La coloration de gramme se réalise en 4 étapes :
Etape1 : les bactéries sont colorées en violet par un colorant basique tel que le violet de
gentiane pendant 30s à 1 min puis par une solution de lugol (20s) en deux fois pour assurer la
fixation de colorant interne.
Etape2 : les bactéries sont soumises à l'action de l'alcool ou d'un mélange alcool + acétone (5
à 10s). Les bactéries se répartissent en deux catégories : celles qui conservent la coloration
violette et qui sont qualifiées de bactéries à Gram positif et d’autres qui deviennent roses et
qui sont appelées bactéries à Gram négatif.
Le mécanisme de cette coloration est connu. Le violet de gentiane se fixe sur des composants
cytoplasmiques et après ce temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les
bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool
+ acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi
constitue une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet
Etape3 : afin de mieux visualiser les bactéries décolorées, on procède à un traitement par la
fuschine (30s à 1min). Les bactéries à Gram positif apparaissent alors violettes et les bactéries
à Gram négatif se recolorent en rose.
Etape 4 : observation microscopique à grossissement (x 1000) avec une goutte d’huile a
immersion
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