Chapitre 2
Matériels & Méthodes
83
2.5.2.7.9. Techniques usuelles de caractérisation, d’isolement et d’identification
des bactéries
A- La coloration de Gram :
Cette technique doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mit au
point son protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les
propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les
classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans
un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme. Elle permet de séparer les bactéries à
Gram positif, dotées d'une simple paroi avec une grande quantité de peptidoglycane (ex :
Staphylococcus aureus), des bactéries à Gram négatif, composées de moins de peptidoglycane
mais pourvues d'une membrane externe supplémentaire (ex : Escherichia coli).
La procédure de cette méthode est la suivante : on étale les bactéries sur une lame de
verre, on les fixe par la chaleur ou l'alcool, puis on les colore successivement avec une
solution de violet de gentiane et un mordant, la liqueur de Gram, ou solution de Lugol
(mélange d'iode et d'iodure de potassium) ; la préparation est ensuite traitée avec un solvant
organique, l'alcool. Les bactéries à Gram positif résistent à la décoloration par l'alcool, tandis
que les bactéries à Gram négatif sont rapidement décolorées. Après le solvant, on procède à
une contre-coloration avec un colorant rouge, la fuchsine de Ziehl. Les bactéries à Gram
positif apparaissent en violet, tandis que les bactéries à Gram négatif, qui acceptent le contrecolorant, sont rouge clair ou rose (SINGLETON et SAINSBURY, 1984).
Figure 2.36 : Principe de la coloration de Gram
B- Test de la catalase :
La catalase est une enzyme catalysant la dismutation de l'eau oxygénée (peroxyde
d'hydrogène, H2O2), c’est-à-dire qu’elle déclenche la réaction d'oxydo-réduction dans laquelle
le peroxyde d'hydrogène donne deux espèces de degrés d'oxydation différents comme suit :
2H2O2
O2 + 2H2O
Son utilisation en bactériologie systématique pour l'identification des bactéries consiste
à mettre en contact une colonie de la bactérie à étudier avec de l'eau oxygénée (à 10 volumes).
Une effervescence (dû à un dégagement de dioxygène) signe sa présence, on dit alors que la
bactérie est catalase positive.
COLORATION DE GRAM
Bactéries Gram +
Étapes
Bactéries Gram -
Fixation par la Chaleur ou l’Alcool
Coloration au Violet de Gentiane
Mordançage au Lugol
Décoloration à l’Alcool
Contre-Coloration à la Fuchsine
Matériels & Méthodes
83
2.5.2.7.9. Techniques usuelles de caractérisation, d’isolement et d’identification
des bactéries
A- La coloration de Gram :
Cette technique doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mit au
point son protocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les
propriétés de la paroi bactérienne, et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les
classifier. Son avantage est de donner une information rapide sur les bactéries présentes dans
un produit ou un milieu tant sur le type que sur la forme. Elle permet de séparer les bactéries à
Gram positif, dotées d'une simple paroi avec une grande quantité de peptidoglycane (ex :
Staphylococcus aureus), des bactéries à Gram négatif, composées de moins de peptidoglycane
mais pourvues d'une membrane externe supplémentaire (ex : Escherichia coli).
La procédure de cette méthode est la suivante : on étale les bactéries sur une lame de
verre, on les fixe par la chaleur ou l'alcool, puis on les colore successivement avec une
solution de violet de gentiane et un mordant, la liqueur de Gram, ou solution de Lugol
(mélange d'iode et d'iodure de potassium) ; la préparation est ensuite traitée avec un solvant
organique, l'alcool. Les bactéries à Gram positif résistent à la décoloration par l'alcool, tandis
que les bactéries à Gram négatif sont rapidement décolorées. Après le solvant, on procède à
une contre-coloration avec un colorant rouge, la fuchsine de Ziehl. Les bactéries à Gram
positif apparaissent en violet, tandis que les bactéries à Gram négatif, qui acceptent le contrecolorant, sont rouge clair ou rose (SINGLETON et SAINSBURY, 1984).
Figure 2.36 : Principe de la coloration de Gram
B- Test de la catalase :
La catalase est une enzyme catalysant la dismutation de l'eau oxygénée (peroxyde
d'hydrogène, H2O2), c’est-à-dire qu’elle déclenche la réaction d'oxydo-réduction dans laquelle
le peroxyde d'hydrogène donne deux espèces de degrés d'oxydation différents comme suit :
2H2O2
O2 + 2H2O
Son utilisation en bactériologie systématique pour l'identification des bactéries consiste
à mettre en contact une colonie de la bactérie à étudier avec de l'eau oxygénée (à 10 volumes).
Une effervescence (dû à un dégagement de dioxygène) signe sa présence, on dit alors que la
bactérie est catalase positive.
COLORATION DE GRAM
Bactéries Gram +
Étapes
Bactéries Gram -
Fixation par la Chaleur ou l’Alcool
Coloration au Violet de Gentiane
Mordançage au Lugol
Décoloration à l’Alcool
Contre-Coloration à la Fuchsine