Chapitre II : Matériel et méthode.
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composées de moins de peptidoglycane mais pourvues d’une membrane externe
supplémentaire.
II.4.3.1 Principe
Le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et après un temps de
coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi,
riche en lipides, laisse passer l’alcool (ou le mélange alcool + acétone) qui décolore le
cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière
imperméable à l’alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.
II.4.3.2 Mode opératoire
- Etaler les bactéries sur une lame de verre ;
- Fixer le frottis à la chaleur et colorer pendant une minute avec une solution de violet
de gentiane ;
- Fixer la coloration du frottis par une solution iodo-ioduré de lugol, pendant une
minute ;
- Décolorer le frottis avec l’alcool à 95 % pendant quelques secondes (30sec), puis
rincé immédiatement avec l’eau du robinet ;
- Traiter le frottis avec une solution de Fushine pendant une minute ;
- Rincer rapidement au robinet et sécher.
Lecture :
Après ce traitement, les cellules Gram négatif apparaissent roses et les cellules Gram positif
apparaissent sous une couleur violette (SINGLETON et SAINBURY, 1984)
II.4.4 Test de la biodégradation sur différentes sources de
carbone
II.4.4.1 Principe
Les bactéries isolées sont différenciées en fonction des hydrocarbures qu’elles sont capables
de métaboliser, pour cela les souches ont été inoculer dans du milieu additionné à : pétrole
brut, un mélange d’alcane (C14 +C16 +C18), hexacosane (C26), octacosane (C28), toluène,
xylène, benzène comme unique source de carbone.