Table des matières

 

 

 
III.2 Echantillonnage. ........................................................................................................ 81
CHAPITRE IV: Matériel et méthodes.
IV.1 Mesure des paramètres physico-chimiques. .............................................................. 84
IV.1.1 Salinité et température. ........................................................................................ 84
IV.1.2 Potentiel hydrogène « pH ». ................................................................................ 84
IV.1.3 Matières en suspension « MES ». ....................................................................... 84
IV.1.4 Demande chimique en oxygène « DCO ». .......................................................... 84
IV.2 Test d’écotoxicité « Microtox ». ................................................................................ 86
IV.3 Mesure de l’abondance bactérienne. .......................................................................... 87
IV.4 Détermination de la diversité bactérienne dans les échantillons de sédiment et d’eau
de mer par DGGE. ................................................................................................................ 88
IV.4.1 Principe de la DGGE. .......................................................................................... 88
IV.4.2 Extraction d'ADN. ............................................................................................... 90
IV.4.2.1 Extraction d'ADN des échantillons d’eau de mer. ......................................... 90
IV.4.2.2 Extraction d'ADN des échantillons de sédiment. .......................................... 90
IV.4.2.3 Contrôle de la qualité et de la taille des ADN. .............................................. 91
IV.4.3 Amplification par PCR. ....................................................................................... 91
IV.4.4 Préparation du gel polyacrylamide. ..................................................................... 94
IV.4.5 Dépôt des échantillons et système électrophorétique. ......................................... 96
IV.5 Isolement et caractérisation des bactéries marines dégradant les hydrocarbures. ..... 97
IV.5.1 Enrichissement et isolement de bactéries aérobies dégradant les hydrocarbures 97
IV.5.2 Criblage des souches bactériennes isolées. ......................................................... 98
IV.6 Test de croissance sur différentes sources d’hydrocarbures et cinétiques de
croissance. ............................................................................................................................ 98
IV.7 Caractérisations morphologiques des bactéries isolées. ............................................ 99
IV.8 Caractérisations biochimiques des bactéries isolées. ................................................. 99
IV.8.1 Coloration de Gram. ............................................................................................ 99
IV.8.2 Test de la catalase. ............................................................................................. 100
IV.8.2.1 Principe. ....................................................................................................... 100
IV.8.2.2 Technique : .................................................................................................. 100
IV.8.3 Test d’oxydase. .................................................................................................. 100
IV.8.3.1 Principe. ....................................................................................................... 100
IV.8.3.2 Technique. ................................................................................................... 100
IV.9 Caractérisations moléculaires des bactéries isolées. ................................................ 101
IV.9.1 Analyse taxonomique des gènes d’ARNr 16S et séquençage. .......................... 101
IV.9.2 Amplification des gènes d’ADNr 16 S par PCR. .............................................. 101
IV.9.3 Electrophorèse sur gel d’agarose. ...................................................................... 103
IV.9.4 Purification des produits PCR. .......................................................................... 103
IV.9.5 Séquençage. ....................................................................................................... 103
IV.9.6 Analyse phylogénétique. ................................................................................... 104
IV.10 Détection et amplification des gènes de dégradation en utilisant des amorces
spécifiques par PCR. .......................................................................................................... 104
IV.10.1 Gènes responsables de la dégradation des hydrocarbures aliphatiques. ......... 105
IV.10.1.1 alkB ............................................................................................................ 105
IV.10.2 Gènes responsables de la dégradation des hydrocarbures mono-aromatiques106
IV.10.2.1 XylM .......................................................................................................... 106
IV.10.2.2 xylA ............................................................................................................ 107