492 trOiSiÈMe partie La génétique
3. Certains gènes humains sont trop volumineux pour être insérés dans
des plasmides bactériens. Les cellules bactériennes sont incapables de
modifier les transcrits d’ARN en ARNm. Par ailleurs, même si on contourne
l’étape de maturation de l’ARN en utilisant l’ADNc, les bactéries ne possèdent pas l’enzyme qui catalyse la maturation posttraductionnelle que
subissent de nombreuses protéines humaines pour être fonctionnelles.
4. Au cours de la réplication des extrémités des molécules linéaires
d’ADN (voir la figure 16.20, p. 368), on utilise une amorce d’ARN à
l’extrémité 5 de chaque nouveau brin. L’ARN doit être remplacé par des
nucléotides d’ADN, mais l’ADN polymérase est incapable de commencer
la synthèse à l’extrémité 5 du nouveau brin d’ADN. Au cours de l’ACP,
comme les amorces sont constituées de nucléotides d’ADN, il n’est pas
nécessaire de les remplacer ; elles constituent seulement des parties de
chaque nouveau brin. Par conséquent, au cours de l’ACP, la réplication
des extrémités ne pose pas de problèmes et les fragments ne sont pas
raccourcis à chaque réplication.
retour sur le concept 20.2
1. Les enzymes de restriction découpent l’ADN génomique en de nombreux endroits, ce qui crée un grand nombre de fragments. À l’issue de
l’électrophorèse, ces fragments apparaîtraient sous forme de bandes étalées plutôt que de zones distinctes après coloration. 2. Dans le buvardage
de Southern, le buvardage de Northern et l’analyse de microréseaux,
la sonde marquée se lie exclusivement à la séquence cible spécifique en
raison de l’hybridation des acides nucléiques supplémentaires (hybridation ADNADN dans le buvardage de Southern et l’analyse de microréseaux, hybridation ADNARN dans le buvardage de Northern). Dans
le séquençage de l’ADN, les amorces se lient par appariement des bases
complémentaires avec la matrice, ce qui permet de démarrer la synthèse
de l’ADN. Dans la RTPCR, les amorces doivent se lier par appariement
des bases complémentaires avec leurs séquences cibles dans le mélange
d’ADN. 3. Un SNP est un seul nucléotide qui varie dans une population,
existant en deux ou plusieurs variations. Un PTFR est un type de SNP qui
se produit sur un site de restriction, menant à des fragments de restriction
de longueur variable quand deux variantes sont coupées par une enzyme de
restriction. 4. Si un point est vert, le gène représenté sur ce point est
exprimé seulement dans le tissu normal. S’il est rouge, le gène est exprimé
seulement dans le tissu cancéreux. S’il est jaune, le gène est exprimé dans
les deux tissus. Enfin, s’il est noir, le gène n’est exprimé dans aucun des
deux types de tissus. En tant que chercheur intéressé par le développement du cancer, vous pourriez étudier les gènes représentés par les points
en vert et en rouge parce que ce sont les gènes pour lesquels le niveau
d’expression diffère entre les deux types de tissus. Quelquesuns de ces
gènes peuvent être exprimés différemment à la suite d’un cancer, mais
d’autres pourraient jouer un rôle dans la cause du cancer.
retour sur le concept 20.3
1. La chromatine du noyau issu des cellules intestinales avait probablement subi plus de modifications que celle d’un noyau provenant d’un
œuf fécondé. C’est pourquoi le nombre de noyaux reprogrammés est
beaucoup plus faible. À l’opposé, la chromatine dans un noyau provenant d’une cellule au stade des quatre cellules aurait davantage ressemblé à celle d’un noyau dans un œuf fécondé. Par conséquent, il aurait
été beaucoup plus facile de la programmer pour commander le développement. 2. Non, surtout à cause de différences subtiles (et peutêtre pas
si subtiles) dans leur environnement. 3. Il faudrait mettre au point une
technique permettant de transformer une cellule SPi humaine en cellule
pancréatique (probablement en provoquant l’expression des gènes régulateurs propres au pancréas). 4. La cellule de carotte a beaucoup plus de
potentiel. Les tentatives de clonage chez les Végétaux montrent qu’une
cellule individuelle de carotte peut générer tous les tissus d’un plant
adulte. Ce n’est pas le cas d’une cellule musculaire, qui restera toujours
une cellule musculaire à cause de son programme génétique (elle exprime
le gène myoD, qui assure une différenciation continue). La cellule musculaire se comporte comme les autres cellules animales complètement
différenciées : elle reste en permanence dans cet état de différenciation
complète, à moins d’être reprogrammée en cellule SPi à l’aide des nouvelles
techniques décrites ici. (Ce qui, par ailleurs, serait très difficile à accomplir
parce qu’une cellule musculaire possède de nombreux noyaux.)
retour sur le concept 20.4
1. Les cellules souches continuent de se reproduire spontanément.
2. La résistance aux herbicides, la résistance aux ravageurs, la résistance
à la maladie, la résistance à la salinité et le retard de la maturation.
3. L’hépatite A étant causée par un virus à ARN, vous pourriez isoler
l’ARN du sang et essayer de détecter des copies de l’ARN de l’hépatite A
par l’une des trois méthodes suivantes. Premièrement, vous pourriez
appliquer l’ARN sur un gel puis faire un buvardage de Northern à l’aide
de sondes complémentaires aux séquences du génome de l’hépatite A.
Une deuxième stratégie consisterait à utiliser la transcriptase inverse pour
produire l’ADNc à partir de l’ARN dans le sang, puis à appliquer l’ADNc
sur un gel et faire un buvardage de Southern à l’aide de la même sonde.
Cependant, ni l’une ni l’autre de ces méthode ne serait aussi sensible que
la RTPCR, grâce à laquelle vous pourriez effectuer la traduction inverse
de l’ARN du sang en ADNc. Il faudrait ensuite utiliser l’ACP pour amplifier l’ADNc, à l’aide d’amorces spécifiques des séquences de l’hépatite A.
Si vous appliquez alors les produits sur un gel d’électrophorèse,
la présence d’une bande confirmerait votre hypothèse.
Questions du résumé des concepts clés
20.1 Pour obtenir un clone cellulaire contenant un plasmide recombiné,
on commence par s’assurer que le vecteur plasmidique choisi et que la
source d’ADN étranger à cloner sont tous les deux coupés par la même
enzyme de restriction afin de générer des fragments de restriction avec
des extrémités cohésives. Ces fragments sont mélangés, liés, puis réinsérés dans des cellules bactériennes qu’on laisse croître dans un milieu de
culture contenant de l’ampicilline, un antibiotique. Comme le plasmide
utilisé contient deux gènes, il est possible de sélectionner les clones
recombinés. Le premier est un gène déterminant la résistance à l’ampicilline, qui permet seulement la croissance des cellules qui ont absorbé un
plasmide. Le deuxième est un gène codant pour la bgalactosidase. Si le
gène est intact, cette enzyme génère un produit bleu dans le milieu de
culture. Comme le site de clonage est situé dans le gène, seules les colonies non recombinées seront bleues. Les plasmides recombinés se trouveront donc dans les cellules des colonies blanches. 20.2 De nombreuses
techniques utilisées pour l’analyse des gènes et leur expression mettent
en jeu l’hybridation des acides nucléiques : les buvardages de Southern et
de Northern, le séquençage de l’ADN, l’ACP, l’hybridation in situ et l’analyse des microréseaux à ADN. L’appariement de bases entre les deux brins
d’une molécule d’ADN ou entre un brin d’ADN et un brin d’ARN
constitue la clé qui permet de trouver des séquences spécifiques d’acides
nucléiques dans toutes ces techniques. 20.3 Le clonage d’une souris
nécessite la transplantation d’un noyau d’une cellule différenciée de
souris dans un ovocyte de deuxième ordre énucléé provenant d’une
autre souris. Il faut ensuite féconder l’ovocyte de deuxième ordre et
favoriser son développement en un embryon. Celuici est alors transplanté chez une mère porteuse. Le souriceau est génétiquement identique
à la souris qui a donné le noyau. Dans ce cas, le noyau différencié a été
reprogrammé sous l’influence de facteurs dans le cytoplasme de l’ovocyte. Les cellules SE de la souris étant générées par les cellules internes
dans les blastocystes, les cellules sont « naturellement » reprogrammées
par les processus de reproduction et de développement. (Les embryons
de souris clonés peuvent également être utilisés comme sources de cellules
SE.) On peut produire des cellules SPi sans utiliser d’embryons, car des
cellules différenciées de souris adulte peuvent se transformer en cellules
souches. Il faut toutefois ajouter certains facteurs de transcription dans
la cellule afin de reprogrammer les cellules pour qu’elles acquièrent leur
pluripotence. 20.4 Premièrement, la maladie doit être causée par un seul
gène, et il faut posséder une bonne connaissance de la base moléculaire
du problème. Deuxièmement, les cellules que l’on veut introduire chez le
patient doivent être capables de s’insérer dans les tissus de l’organisme et
de poursuivre leur multiplication une fois en place (et fournir le produit
génique nécessaire). Troisièmement, il faut s’assurer que le gène sera
inséré dans les cellules en question de façon sécuritaire, car certains
patients ont souffert de cancers à l’issue de plusieurs essais de thérapie
génique. (Notez que cela exige de tester la méthode chez des souris ; de
plus, on ne comprend pas encore très bien la nature des facteurs déterminant si un vecteur est sécuritaire ou non. Peutêtre qu’un d’entre
vous pourra résoudre ce problème !)
3. Certains gènes humains sont trop volumineux pour être insérés dans
des plasmides bactériens. Les cellules bactériennes sont incapables de
modifier les transcrits d’ARN en ARNm. Par ailleurs, même si on contourne
l’étape de maturation de l’ARN en utilisant l’ADNc, les bactéries ne possèdent pas l’enzyme qui catalyse la maturation posttraductionnelle que
subissent de nombreuses protéines humaines pour être fonctionnelles.
4. Au cours de la réplication des extrémités des molécules linéaires
d’ADN (voir la figure 16.20, p. 368), on utilise une amorce d’ARN à
l’extrémité 5 de chaque nouveau brin. L’ARN doit être remplacé par des
nucléotides d’ADN, mais l’ADN polymérase est incapable de commencer
la synthèse à l’extrémité 5 du nouveau brin d’ADN. Au cours de l’ACP,
comme les amorces sont constituées de nucléotides d’ADN, il n’est pas
nécessaire de les remplacer ; elles constituent seulement des parties de
chaque nouveau brin. Par conséquent, au cours de l’ACP, la réplication
des extrémités ne pose pas de problèmes et les fragments ne sont pas
raccourcis à chaque réplication.
retour sur le concept 20.2
1. Les enzymes de restriction découpent l’ADN génomique en de nombreux endroits, ce qui crée un grand nombre de fragments. À l’issue de
l’électrophorèse, ces fragments apparaîtraient sous forme de bandes étalées plutôt que de zones distinctes après coloration. 2. Dans le buvardage
de Southern, le buvardage de Northern et l’analyse de microréseaux,
la sonde marquée se lie exclusivement à la séquence cible spécifique en
raison de l’hybridation des acides nucléiques supplémentaires (hybridation ADNADN dans le buvardage de Southern et l’analyse de microréseaux, hybridation ADNARN dans le buvardage de Northern). Dans
le séquençage de l’ADN, les amorces se lient par appariement des bases
complémentaires avec la matrice, ce qui permet de démarrer la synthèse
de l’ADN. Dans la RTPCR, les amorces doivent se lier par appariement
des bases complémentaires avec leurs séquences cibles dans le mélange
d’ADN. 3. Un SNP est un seul nucléotide qui varie dans une population,
existant en deux ou plusieurs variations. Un PTFR est un type de SNP qui
se produit sur un site de restriction, menant à des fragments de restriction
de longueur variable quand deux variantes sont coupées par une enzyme de
restriction. 4. Si un point est vert, le gène représenté sur ce point est
exprimé seulement dans le tissu normal. S’il est rouge, le gène est exprimé
seulement dans le tissu cancéreux. S’il est jaune, le gène est exprimé dans
les deux tissus. Enfin, s’il est noir, le gène n’est exprimé dans aucun des
deux types de tissus. En tant que chercheur intéressé par le développement du cancer, vous pourriez étudier les gènes représentés par les points
en vert et en rouge parce que ce sont les gènes pour lesquels le niveau
d’expression diffère entre les deux types de tissus. Quelquesuns de ces
gènes peuvent être exprimés différemment à la suite d’un cancer, mais
d’autres pourraient jouer un rôle dans la cause du cancer.
retour sur le concept 20.3
1. La chromatine du noyau issu des cellules intestinales avait probablement subi plus de modifications que celle d’un noyau provenant d’un
œuf fécondé. C’est pourquoi le nombre de noyaux reprogrammés est
beaucoup plus faible. À l’opposé, la chromatine dans un noyau provenant d’une cellule au stade des quatre cellules aurait davantage ressemblé à celle d’un noyau dans un œuf fécondé. Par conséquent, il aurait
été beaucoup plus facile de la programmer pour commander le développement. 2. Non, surtout à cause de différences subtiles (et peutêtre pas
si subtiles) dans leur environnement. 3. Il faudrait mettre au point une
technique permettant de transformer une cellule SPi humaine en cellule
pancréatique (probablement en provoquant l’expression des gènes régulateurs propres au pancréas). 4. La cellule de carotte a beaucoup plus de
potentiel. Les tentatives de clonage chez les Végétaux montrent qu’une
cellule individuelle de carotte peut générer tous les tissus d’un plant
adulte. Ce n’est pas le cas d’une cellule musculaire, qui restera toujours
une cellule musculaire à cause de son programme génétique (elle exprime
le gène myoD, qui assure une différenciation continue). La cellule musculaire se comporte comme les autres cellules animales complètement
différenciées : elle reste en permanence dans cet état de différenciation
complète, à moins d’être reprogrammée en cellule SPi à l’aide des nouvelles
techniques décrites ici. (Ce qui, par ailleurs, serait très difficile à accomplir
parce qu’une cellule musculaire possède de nombreux noyaux.)
retour sur le concept 20.4
1. Les cellules souches continuent de se reproduire spontanément.
2. La résistance aux herbicides, la résistance aux ravageurs, la résistance
à la maladie, la résistance à la salinité et le retard de la maturation.
3. L’hépatite A étant causée par un virus à ARN, vous pourriez isoler
l’ARN du sang et essayer de détecter des copies de l’ARN de l’hépatite A
par l’une des trois méthodes suivantes. Premièrement, vous pourriez
appliquer l’ARN sur un gel puis faire un buvardage de Northern à l’aide
de sondes complémentaires aux séquences du génome de l’hépatite A.
Une deuxième stratégie consisterait à utiliser la transcriptase inverse pour
produire l’ADNc à partir de l’ARN dans le sang, puis à appliquer l’ADNc
sur un gel et faire un buvardage de Southern à l’aide de la même sonde.
Cependant, ni l’une ni l’autre de ces méthode ne serait aussi sensible que
la RTPCR, grâce à laquelle vous pourriez effectuer la traduction inverse
de l’ARN du sang en ADNc. Il faudrait ensuite utiliser l’ACP pour amplifier l’ADNc, à l’aide d’amorces spécifiques des séquences de l’hépatite A.
Si vous appliquez alors les produits sur un gel d’électrophorèse,
la présence d’une bande confirmerait votre hypothèse.
Questions du résumé des concepts clés
20.1 Pour obtenir un clone cellulaire contenant un plasmide recombiné,
on commence par s’assurer que le vecteur plasmidique choisi et que la
source d’ADN étranger à cloner sont tous les deux coupés par la même
enzyme de restriction afin de générer des fragments de restriction avec
des extrémités cohésives. Ces fragments sont mélangés, liés, puis réinsérés dans des cellules bactériennes qu’on laisse croître dans un milieu de
culture contenant de l’ampicilline, un antibiotique. Comme le plasmide
utilisé contient deux gènes, il est possible de sélectionner les clones
recombinés. Le premier est un gène déterminant la résistance à l’ampicilline, qui permet seulement la croissance des cellules qui ont absorbé un
plasmide. Le deuxième est un gène codant pour la bgalactosidase. Si le
gène est intact, cette enzyme génère un produit bleu dans le milieu de
culture. Comme le site de clonage est situé dans le gène, seules les colonies non recombinées seront bleues. Les plasmides recombinés se trouveront donc dans les cellules des colonies blanches. 20.2 De nombreuses
techniques utilisées pour l’analyse des gènes et leur expression mettent
en jeu l’hybridation des acides nucléiques : les buvardages de Southern et
de Northern, le séquençage de l’ADN, l’ACP, l’hybridation in situ et l’analyse des microréseaux à ADN. L’appariement de bases entre les deux brins
d’une molécule d’ADN ou entre un brin d’ADN et un brin d’ARN
constitue la clé qui permet de trouver des séquences spécifiques d’acides
nucléiques dans toutes ces techniques. 20.3 Le clonage d’une souris
nécessite la transplantation d’un noyau d’une cellule différenciée de
souris dans un ovocyte de deuxième ordre énucléé provenant d’une
autre souris. Il faut ensuite féconder l’ovocyte de deuxième ordre et
favoriser son développement en un embryon. Celuici est alors transplanté chez une mère porteuse. Le souriceau est génétiquement identique
à la souris qui a donné le noyau. Dans ce cas, le noyau différencié a été
reprogrammé sous l’influence de facteurs dans le cytoplasme de l’ovocyte. Les cellules SE de la souris étant générées par les cellules internes
dans les blastocystes, les cellules sont « naturellement » reprogrammées
par les processus de reproduction et de développement. (Les embryons
de souris clonés peuvent également être utilisés comme sources de cellules
SE.) On peut produire des cellules SPi sans utiliser d’embryons, car des
cellules différenciées de souris adulte peuvent se transformer en cellules
souches. Il faut toutefois ajouter certains facteurs de transcription dans
la cellule afin de reprogrammer les cellules pour qu’elles acquièrent leur
pluripotence. 20.4 Premièrement, la maladie doit être causée par un seul
gène, et il faut posséder une bonne connaissance de la base moléculaire
du problème. Deuxièmement, les cellules que l’on veut introduire chez le
patient doivent être capables de s’insérer dans les tissus de l’organisme et
de poursuivre leur multiplication une fois en place (et fournir le produit
génique nécessaire). Troisièmement, il faut s’assurer que le gène sera
inséré dans les cellules en question de façon sécuritaire, car certains
patients ont souffert de cancers à l’issue de plusieurs essais de thérapie
génique. (Notez que cela exige de tester la méthode chez des souris ; de
plus, on ne comprend pas encore très bien la nature des facteurs déterminant si un vecteur est sécuritaire ou non. Peutêtre qu’un d’entre
vous pourra résoudre ce problème !)