132
5 • Techniques et biotechnologies
La technique peut être affinée si l’on ajoute une nucléase qui supprimera tous les fragments non appariés.
Il est souvent nécessaire d’obtenir des mutations plus ponctuelles et
l’une des méthodes utilisées est celle de la mutagenèse dirigée qui doit
utiliser un vecteur particulier comme le phage M13. Ce phage a la particularité d’être un phage monobrin qui peut se répliquer et former
deux brins sous l’action d’une ADN polymérase après avoir transfecté
une bactérie. La technique permet d’obtenir par exemple des sondes
légèrement plus petites que leur original et qui pourront servir de
témoin lors d’une amplification PCR.
5.3.3 Animaux transgéniques
La transfection dans une culture cellulaire fournit des renseignements
utiles sur la régulation de l’expression d’un gène donné, mais l’interprétation des résultats est toujours limitée par le fait qu’il s’agit de cellules en culture, isolées de leur contexte. La technologie transgénique
pallie à cet inconvénient en permettant l’incorporation de constructions dans des cellules germinales et permettant ainsi à la fois une diffusion du transfert génique à tout l’organisme et sa transmission à sa
descendance.
Cette technique consiste à injecter une construction génique dans
les cellules germinales d’un animal (ce qu’il est formellement interdit de
faire chez l’homme). La pénétration de la construction dans le génome est,
avec la technique habituelle, aléatoire, c’est-à-dire qu’elle peut se faire
n’importe où dans le génome, y compris dans des zones dites silencieuses, et le rendement de la technique est faible de l’ordre de 4-5 %.
L’injection est une micro-injection à la seringue, elle se fait dans le
pronucleus mâle d’un oocyte fertilisé de souris (fig. 54). La construction pénètre ainsi directement dans le noyau et s’intégrera, généralement
en cascade, c’est-à-dire que plusieurs constructions s’intégreront à la
queue leu leu dans le génome en même temps. Il faudra ensuite examiner l’ADN des portées de souriceaux et rechercher la construction initiale par PCR. Les animaux positifs, possédant la construction, seront
sélectionnés. Comme il s’agit par définition d’hétérozygotes (puisque
5 • Techniques et biotechnologies
La technique peut être affinée si l’on ajoute une nucléase qui supprimera tous les fragments non appariés.
Il est souvent nécessaire d’obtenir des mutations plus ponctuelles et
l’une des méthodes utilisées est celle de la mutagenèse dirigée qui doit
utiliser un vecteur particulier comme le phage M13. Ce phage a la particularité d’être un phage monobrin qui peut se répliquer et former
deux brins sous l’action d’une ADN polymérase après avoir transfecté
une bactérie. La technique permet d’obtenir par exemple des sondes
légèrement plus petites que leur original et qui pourront servir de
témoin lors d’une amplification PCR.
5.3.3 Animaux transgéniques
La transfection dans une culture cellulaire fournit des renseignements
utiles sur la régulation de l’expression d’un gène donné, mais l’interprétation des résultats est toujours limitée par le fait qu’il s’agit de cellules en culture, isolées de leur contexte. La technologie transgénique
pallie à cet inconvénient en permettant l’incorporation de constructions dans des cellules germinales et permettant ainsi à la fois une diffusion du transfert génique à tout l’organisme et sa transmission à sa
descendance.
Cette technique consiste à injecter une construction génique dans
les cellules germinales d’un animal (ce qu’il est formellement interdit de
faire chez l’homme). La pénétration de la construction dans le génome est,
avec la technique habituelle, aléatoire, c’est-à-dire qu’elle peut se faire
n’importe où dans le génome, y compris dans des zones dites silencieuses, et le rendement de la technique est faible de l’ordre de 4-5 %.
L’injection est une micro-injection à la seringue, elle se fait dans le
pronucleus mâle d’un oocyte fertilisé de souris (fig. 54). La construction pénètre ainsi directement dans le noyau et s’intégrera, généralement
en cascade, c’est-à-dire que plusieurs constructions s’intégreront à la
queue leu leu dans le génome en même temps. Il faudra ensuite examiner l’ADN des portées de souriceaux et rechercher la construction initiale par PCR. Les animaux positifs, possédant la construction, seront
sélectionnés. Comme il s’agit par définition d’hétérozygotes (puisque