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B IOLOGIE CELLULAIRE
n =indice de réfraction du milieu situé entre l’objet
et la lentille objectif ;
α = demi-angle d’ouverture de l’objectif.
On appelle le produit n .sin α : ouverture numérique de la lentille.
La valeur de d devant être aussi faible que possible, il faut donc diminuer au maximum λ et augmenter l’ouverture numérique. Ceci se fait en
sélectionnant dans la lumière blanche naturelle
des longueurs d’onde proches du violet, grâce à
un filtre approprié. On peut aussi utiliser la lumière
ultraviolette mais l’observation directe n’est pas
possible (nécessité de clichés), et cela implique de
coûteuses optiques en quartz, seules transparentes
à ces rayonnements. L’ouverture numérique peut
être significativement augmentée en remplaçant
l’air ( n = 1) entre la lentille et l’objet (cas des objectifs habituels) par une huile transparente dont l’indice de réfraction est élevé ( n = 1,52) ; on parle
alors d’observation à l’immersion et d’huile à
immersion (voir figure 2.3). Dans les meilleures
conditions, le pouvoir séparateur du microscope
photonique atteint sa limite théorique, qui est
comprise entre 0,2 et 0,3 µ m.
La notion classique de profondeur de champ
s’applique à l’observation microscopique : l’observateur n’a une vision nette, le long de l’axe
optique, que sur une certaine épaisseur de l’objet.
Pour ne pas obtenir une image brouillée et déformée par le fait que les rayons lumineux traversent
des milieux hétérogènes au-dessus et en dessous
de la zone nettement vue, il faut en principe observer des échantillons très minces. La profondeur de
champ est d’autant plus faible que les objectifs utilisés sont plus puissants. Lorsqu’on a un objet
transparent épais, on peut cependant avoir une
vision assez correcte de ses structures internes en
réalisant des coupes optiques, c’est-à-dire en faisant des mises au point successives et en réalisant
des observations partielles (plan après plan) pouvant conduire finalement à une reconstitution
dans l’espace. La mise au point récente du microscope confocal, permettant d’obtenir une observation sur un seul plan, même de très faible
épaisseur, d’objets épais constitue un progrès
considérable qui a été exploité en immunofluorescence ; son principe sera exposé dans le chapitre 11.
D’autres perfectionnements importants ont été
apportés au microscope photonique au cours de ce
siècle, tels le contraste de phase (ZERNICKE, 1932),
le contraste interférentiel (NOMARSKI, 1952) et la
vidéoamplification (1981).
2.I.2. M ICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Son principe est comparable à celui du microscope photonique, à la différence près que le faisceau de photons est remplacé par un faisceau
d’électrons. La longueur d’onde associée à un faisceau d’électrons est d’autant plus courte que leur
vitesse est plus élevée : lorsque ceux-ci sont accélérés sous vide sous une tension de 50 000 volts,
celle-ci est de 0,005 nm, c’est-à-dire 10
5
fois plus
courte que celle de la lumière visible moyenne ;
cette longueur d’onde est beaucoup plus petite
que la taille d’un atome d’hydrogène (voisine de
0,1 nm). La limite de résolution théorique d’un tel
instrument est donc très inférieure à celle du
microscope à lumière. Pour différentes causes
techniques, le pouvoir séparateur obtenu n’est pas
celui attendu, mais il atteint néanmoins 0,2 nm et
est 10 00 fois plus élevé que pour le microscope
classique. Les images obtenues peuvent être
agrandies directement jusqu’à 500 000 fois, et bien
plus avec l’agrandissement photographique.
Lorsque le faisceau incident d’électrons primaires traverse l’objet à analyser, ceux-ci sont
absorbés ou réfléchis par certains de ses atomes et
ils ne participent donc pas à la formation de
l’image. Les atomes majeurs de la matière vivante
Figure 2.3
Coupe d’un objectif à immersion utilisé avec huile
(partie gauche) ou sans huile (partie droite)
Cette coupe montre la différence des trajets suivis par les
rayons lumineux dans les deux cas. L’utilisation d’huile
contribue à augmenter significativement l’angle d’ouverture u depuis le point appartenant à l’objet observé
(o), situé sous la lamelle (l). lf : lentille frontale ; L:lame.
If
u u
o
l
L
B IOLOGIE CELLULAIRE
n =indice de réfraction du milieu situé entre l’objet
et la lentille objectif ;
α = demi-angle d’ouverture de l’objectif.
On appelle le produit n .sin α : ouverture numérique de la lentille.
La valeur de d devant être aussi faible que possible, il faut donc diminuer au maximum λ et augmenter l’ouverture numérique. Ceci se fait en
sélectionnant dans la lumière blanche naturelle
des longueurs d’onde proches du violet, grâce à
un filtre approprié. On peut aussi utiliser la lumière
ultraviolette mais l’observation directe n’est pas
possible (nécessité de clichés), et cela implique de
coûteuses optiques en quartz, seules transparentes
à ces rayonnements. L’ouverture numérique peut
être significativement augmentée en remplaçant
l’air ( n = 1) entre la lentille et l’objet (cas des objectifs habituels) par une huile transparente dont l’indice de réfraction est élevé ( n = 1,52) ; on parle
alors d’observation à l’immersion et d’huile à
immersion (voir figure 2.3). Dans les meilleures
conditions, le pouvoir séparateur du microscope
photonique atteint sa limite théorique, qui est
comprise entre 0,2 et 0,3 µ m.
La notion classique de profondeur de champ
s’applique à l’observation microscopique : l’observateur n’a une vision nette, le long de l’axe
optique, que sur une certaine épaisseur de l’objet.
Pour ne pas obtenir une image brouillée et déformée par le fait que les rayons lumineux traversent
des milieux hétérogènes au-dessus et en dessous
de la zone nettement vue, il faut en principe observer des échantillons très minces. La profondeur de
champ est d’autant plus faible que les objectifs utilisés sont plus puissants. Lorsqu’on a un objet
transparent épais, on peut cependant avoir une
vision assez correcte de ses structures internes en
réalisant des coupes optiques, c’est-à-dire en faisant des mises au point successives et en réalisant
des observations partielles (plan après plan) pouvant conduire finalement à une reconstitution
dans l’espace. La mise au point récente du microscope confocal, permettant d’obtenir une observation sur un seul plan, même de très faible
épaisseur, d’objets épais constitue un progrès
considérable qui a été exploité en immunofluorescence ; son principe sera exposé dans le chapitre 11.
D’autres perfectionnements importants ont été
apportés au microscope photonique au cours de ce
siècle, tels le contraste de phase (ZERNICKE, 1932),
le contraste interférentiel (NOMARSKI, 1952) et la
vidéoamplification (1981).
2.I.2. M ICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
Son principe est comparable à celui du microscope photonique, à la différence près que le faisceau de photons est remplacé par un faisceau
d’électrons. La longueur d’onde associée à un faisceau d’électrons est d’autant plus courte que leur
vitesse est plus élevée : lorsque ceux-ci sont accélérés sous vide sous une tension de 50 000 volts,
celle-ci est de 0,005 nm, c’est-à-dire 10
5
fois plus
courte que celle de la lumière visible moyenne ;
cette longueur d’onde est beaucoup plus petite
que la taille d’un atome d’hydrogène (voisine de
0,1 nm). La limite de résolution théorique d’un tel
instrument est donc très inférieure à celle du
microscope à lumière. Pour différentes causes
techniques, le pouvoir séparateur obtenu n’est pas
celui attendu, mais il atteint néanmoins 0,2 nm et
est 10 00 fois plus élevé que pour le microscope
classique. Les images obtenues peuvent être
agrandies directement jusqu’à 500 000 fois, et bien
plus avec l’agrandissement photographique.
Lorsque le faisceau incident d’électrons primaires traverse l’objet à analyser, ceux-ci sont
absorbés ou réfléchis par certains de ses atomes et
ils ne participent donc pas à la formation de
l’image. Les atomes majeurs de la matière vivante
Figure 2.3
Coupe d’un objectif à immersion utilisé avec huile
(partie gauche) ou sans huile (partie droite)
Cette coupe montre la différence des trajets suivis par les
rayons lumineux dans les deux cas. L’utilisation d’huile
contribue à augmenter significativement l’angle d’ouverture u depuis le point appartenant à l’objet observé
(o), situé sous la lamelle (l). lf : lentille frontale ; L:lame.
If
u u
o
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L