370 B IOLOGIE CELLULAIRE
une succession de segments d’ADN, juxtaposés
mais non soudés, représentant le deuxième brin
néosynthétisé : ce sont les fragments d’Okasaki,
qui sont enfin reliés par des liaisons phosphoester
grâce à une ligase, enzyme consommant de l’ATP
pour réaliser cette opération.
Toutes les enzymes impliquées dans la polymérisation constituent un très gros édifice fonctionnant au cœur de la fourche, incluant deux
molécules d’ADN polymérase (une pour chaque
brin) ainsi qu’un complexe associant l’hélicase et
la primase. D’autres protéines sont mises en jeu au
niveau de la fourche : il s’agit des protéines de stabilisation du simple brin, qui se fixent sur le brin
matrice utilisé à contre-courant ; leur rôle est
d’empêcher que celui-ci ne se renature sur luimême si des séquences auto-complémentaires
existent à proximité l’une de l’autre. La progression
des polymérases serait entravée par l’existence
d’« épingles à cheveux double-brin » se mettant
spontanément en place sans l’intervention de ces
protéines spécifiques.
Il faut enfin évoquer un dernier problème posé
au niveau des fourches : le surenroulement ; à
mesure que l’œil s’agrandit, lors de la réplication,
l’ADN non répliqué qui se trouve de part et d’autre
est soumis à une tension mécanique (torsion) de
plus en plus grande. Pour visualiser ceci, il suffit
d’ouvrir les brins d’une ficelle double et de les
écarter progressivement : on constate que les deux
extrémités libres se mettent à tourner ; en revanche, si elles ne sont pas libres, l’écartement de l’œil
conduit à l’apparition de vrilles et, pour cette raison, il existe une limite à la taille de l’œil qui peut
être ouvert. Or, ce problème se pose au sein des
chromosomes, soit parce qu’ils sont fermés sur
eux-mêmes (cas des ADN bactériens), soit parce
que les longues molécules linéaires sont fixées au
niveau de structures les empêchant de tourner
librement, et forment des boucles (cas des Eucaryotes). Les cellules disposent en fait d’un système
qui permet à l’ADN de tourner librement en avant
des fourches : des enzymes spécifiques coupent la
molécule, soit sur un brin, soit sur les deux, et la
referment. Dans l’intervalle, l’ADN a pu tourner et
libérer la tension mécanique, à la manière de ce
qui se passe au niveau d’un émerillon placé le long
d’une chaîne ; on appelle topoisomérases ces
enzymes qui changent simplement la topologie
des molécules d’ADN.
La réplication, qui implique un nombre important de protéines distinctes, est donc un phénomène d’une extrême complexité. Cependant, grâce
à divers mécanismes de vérification et de correction du message recopié, ce processus présente
une fidélité remarquable, puisqu’une seule erreur
sur 10
9
paires de bases est commise. Ce sont ces
mutations qui, lorsqu’elles sont tolérées par les
organismes, sont responsables du fait que la vie
n’est pas indéfiniment restée figée dans un même
schéma depuis son apparition sur la terre (voir
chapitre 1). Il existe enfin des mécanismes permettant la réparation de l’ADN accidentellement
endommagé par des agents chimiques ou physiques, qui utilisent des processus communs à ceux
mis en jeu dans la réplication (voir plus loin).
2.4. Duplication du chromosome bactérien
2.4.1. M ISE EN ÉVIDENCE CYTOLOGIQUE
DU PHÉNOMÈNE
Les premières expériences relatives à cette question datent de 1963 (J. C AIRNS);elles font date dans
l’histoire de la biologie moléculaire car elles ont
fourni les premières images du chromosome bactérien complet en train de se dupliquer. Elles sont
basées sur l’utilisation de précurseurs radioactifs
de l’ADN, afin de le visualiser par autoradiographie (voir chapitre 3), et sur la mise au point de
techniques très douces d’isolement du chromosome bactérien (voir l’encart suivant).
La visualisation de la réplication
de l’ADN bactérien
Des cellules de E. coli sont mises en culture dans
un milieu contenant de la thymidine
3
H, qui
s’incorpore exclusivement dans l’ADN. Après
des temps d’incubation variables, les cellules
sont lysées en présence de détergent et soumises à un choc osmotique : elles éclatent donc
en répandant leur contenu, y compris leur chromosome, qui se déroule plus ou moins. Les opérations se déroulent directement sur une lame
de verre qui sert de support aux molécules
d’ADN. Dans la mesure où les Bactéries ne sont
pas manipulées et agitées, on peut imaginer que
leur chromosome reste intact ; la solution de
lyse contient en outre des protéines basiques
qui se fixent sur lui et le consolident. L’autoradiographie appliquée à ces préparations permet
E NCARTH ISTORIQUE
une succession de segments d’ADN, juxtaposés
mais non soudés, représentant le deuxième brin
néosynthétisé : ce sont les fragments d’Okasaki,
qui sont enfin reliés par des liaisons phosphoester
grâce à une ligase, enzyme consommant de l’ATP
pour réaliser cette opération.
Toutes les enzymes impliquées dans la polymérisation constituent un très gros édifice fonctionnant au cœur de la fourche, incluant deux
molécules d’ADN polymérase (une pour chaque
brin) ainsi qu’un complexe associant l’hélicase et
la primase. D’autres protéines sont mises en jeu au
niveau de la fourche : il s’agit des protéines de stabilisation du simple brin, qui se fixent sur le brin
matrice utilisé à contre-courant ; leur rôle est
d’empêcher que celui-ci ne se renature sur luimême si des séquences auto-complémentaires
existent à proximité l’une de l’autre. La progression
des polymérases serait entravée par l’existence
d’« épingles à cheveux double-brin » se mettant
spontanément en place sans l’intervention de ces
protéines spécifiques.
Il faut enfin évoquer un dernier problème posé
au niveau des fourches : le surenroulement ; à
mesure que l’œil s’agrandit, lors de la réplication,
l’ADN non répliqué qui se trouve de part et d’autre
est soumis à une tension mécanique (torsion) de
plus en plus grande. Pour visualiser ceci, il suffit
d’ouvrir les brins d’une ficelle double et de les
écarter progressivement : on constate que les deux
extrémités libres se mettent à tourner ; en revanche, si elles ne sont pas libres, l’écartement de l’œil
conduit à l’apparition de vrilles et, pour cette raison, il existe une limite à la taille de l’œil qui peut
être ouvert. Or, ce problème se pose au sein des
chromosomes, soit parce qu’ils sont fermés sur
eux-mêmes (cas des ADN bactériens), soit parce
que les longues molécules linéaires sont fixées au
niveau de structures les empêchant de tourner
librement, et forment des boucles (cas des Eucaryotes). Les cellules disposent en fait d’un système
qui permet à l’ADN de tourner librement en avant
des fourches : des enzymes spécifiques coupent la
molécule, soit sur un brin, soit sur les deux, et la
referment. Dans l’intervalle, l’ADN a pu tourner et
libérer la tension mécanique, à la manière de ce
qui se passe au niveau d’un émerillon placé le long
d’une chaîne ; on appelle topoisomérases ces
enzymes qui changent simplement la topologie
des molécules d’ADN.
La réplication, qui implique un nombre important de protéines distinctes, est donc un phénomène d’une extrême complexité. Cependant, grâce
à divers mécanismes de vérification et de correction du message recopié, ce processus présente
une fidélité remarquable, puisqu’une seule erreur
sur 10
9
paires de bases est commise. Ce sont ces
mutations qui, lorsqu’elles sont tolérées par les
organismes, sont responsables du fait que la vie
n’est pas indéfiniment restée figée dans un même
schéma depuis son apparition sur la terre (voir
chapitre 1). Il existe enfin des mécanismes permettant la réparation de l’ADN accidentellement
endommagé par des agents chimiques ou physiques, qui utilisent des processus communs à ceux
mis en jeu dans la réplication (voir plus loin).
2.4. Duplication du chromosome bactérien
2.4.1. M ISE EN ÉVIDENCE CYTOLOGIQUE
DU PHÉNOMÈNE
Les premières expériences relatives à cette question datent de 1963 (J. C AIRNS);elles font date dans
l’histoire de la biologie moléculaire car elles ont
fourni les premières images du chromosome bactérien complet en train de se dupliquer. Elles sont
basées sur l’utilisation de précurseurs radioactifs
de l’ADN, afin de le visualiser par autoradiographie (voir chapitre 3), et sur la mise au point de
techniques très douces d’isolement du chromosome bactérien (voir l’encart suivant).
La visualisation de la réplication
de l’ADN bactérien
Des cellules de E. coli sont mises en culture dans
un milieu contenant de la thymidine
3
H, qui
s’incorpore exclusivement dans l’ADN. Après
des temps d’incubation variables, les cellules
sont lysées en présence de détergent et soumises à un choc osmotique : elles éclatent donc
en répandant leur contenu, y compris leur chromosome, qui se déroule plus ou moins. Les opérations se déroulent directement sur une lame
de verre qui sert de support aux molécules
d’ADN. Dans la mesure où les Bactéries ne sont
pas manipulées et agitées, on peut imaginer que
leur chromosome reste intact ; la solution de
lyse contient en outre des protéines basiques
qui se fixent sur lui et le consolident. L’autoradiographie appliquée à ces préparations permet
E NCARTH ISTORIQUE