17 • Méthodes de dosage par marquage
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La méthode précédente prend le nom de dilution isotopique inverse lorsque le composé
à doser est déjà sous forme radioactive. Le principe est le même : on compare l’activité du
produit à doser (mesurée sur une fraction isolée de celui-ci), avant et après dilution avec le
composé non marqué. Les calculs sont identiques.
17.3 MÉTHODE SUBSTŒCHIOMÉTRIQUE
Les expressions 17.2 ou 17.3 montrent qu’il n’est pas nécessaire pour calculer m X de
connaître A X et A S , si on peut accéder directement à leur rapport. Cette observation est
exploitée quand l’analyte est en très faible quantité, donc impossible à récupérer sous sa
forme initiale par un procédé traditionnel.
La méthode consiste à faire un dérivé insoluble du composé à doser pour pouvoir en récupérer une partie. On reproduira de manière identique la réaction de dérivatisation sur le
standard marqué seul (blanc analytique), puis sur l’échantillon, afin d’obtenir un même dérivé. Cette méthode, dite substœchiométrique, préfigure la méthode immunochimique pour
le dosage de traces.
Soit à doser l’ion sulfate présent à l’état de quelques % dans une solution aqueuse. Après
avoir additionné, en tant que marqueur, une quantité connue de
35 SO
2−
4 , on ajoute une solution d’un sel de baryum (formation de BaSO 4 insoluble) en quantité insuffisante par rapport
à celle qu’il faudrait pour précipiter tout l’ion sulfate. En comparant l’activité du précipité
recueilli avec celle du précipité obtenu à partir d’une même quantité de sulfate marqué seul,
dans des conditions expérimentales identiques, on en déduira le rapport des activités, donc
la quantité de sulfate (dilution isotopique inverse).
17.4 TESTS RADIO-IMMUNOLOGIQUES (RIA)
La méthodologie précédente, illustrée par le dosage de l’ion sulfate, a été transposée dès
1960 au dosage de l’insuline dans le sérum. La méthode qui a pris le nom de radioimmunologie, est une application de l’immunochimie in vitro.
L’idée de base est de séparer après mélange le composé faisant l’objet du dosage au
moyen d’un réactif ultraspécifique (anticorps), rendant possible l’étude d’échantillons comportant des milliers d’autres substances. Cette approche a conduit aux immunodosages qui
ont pris un essor fabuleux en bénéficiant du développement du génie génétique et de la
biochimie.
Comme dans la méthode précédente, on mélange à l’échantillon contenant l’analyte,
une quantité connue de ce même analyte sous forme marquée à l’aide d’un radio-isotope
(fig. 17.1). Ensuite, pour isoler une fraction du mélange des deux formes, marquée et non
marquée, on ajoute un anticorps spécifique de ce composé afin de capter un peu des deux
formes. Elles seront dans le même rapport molaire qu’en solution. L’anticorps étant ajouté
en quantité substœchiométrique, on séparera le mélange complexé par précipitation avant
de procéder à son comptage.
La radio-immunologie — restée une méthode de choix pour certaines études de médecine clinique — a reçu peu d’applications pour le dosage des molécules de faible masses
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit
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La méthode précédente prend le nom de dilution isotopique inverse lorsque le composé
à doser est déjà sous forme radioactive. Le principe est le même : on compare l’activité du
produit à doser (mesurée sur une fraction isolée de celui-ci), avant et après dilution avec le
composé non marqué. Les calculs sont identiques.
17.3 MÉTHODE SUBSTŒCHIOMÉTRIQUE
Les expressions 17.2 ou 17.3 montrent qu’il n’est pas nécessaire pour calculer m X de
connaître A X et A S , si on peut accéder directement à leur rapport. Cette observation est
exploitée quand l’analyte est en très faible quantité, donc impossible à récupérer sous sa
forme initiale par un procédé traditionnel.
La méthode consiste à faire un dérivé insoluble du composé à doser pour pouvoir en récupérer une partie. On reproduira de manière identique la réaction de dérivatisation sur le
standard marqué seul (blanc analytique), puis sur l’échantillon, afin d’obtenir un même dérivé. Cette méthode, dite substœchiométrique, préfigure la méthode immunochimique pour
le dosage de traces.
Soit à doser l’ion sulfate présent à l’état de quelques % dans une solution aqueuse. Après
avoir additionné, en tant que marqueur, une quantité connue de
35 SO
2−
4 , on ajoute une solution d’un sel de baryum (formation de BaSO 4 insoluble) en quantité insuffisante par rapport
à celle qu’il faudrait pour précipiter tout l’ion sulfate. En comparant l’activité du précipité
recueilli avec celle du précipité obtenu à partir d’une même quantité de sulfate marqué seul,
dans des conditions expérimentales identiques, on en déduira le rapport des activités, donc
la quantité de sulfate (dilution isotopique inverse).
17.4 TESTS RADIO-IMMUNOLOGIQUES (RIA)
La méthodologie précédente, illustrée par le dosage de l’ion sulfate, a été transposée dès
1960 au dosage de l’insuline dans le sérum. La méthode qui a pris le nom de radioimmunologie, est une application de l’immunochimie in vitro.
L’idée de base est de séparer après mélange le composé faisant l’objet du dosage au
moyen d’un réactif ultraspécifique (anticorps), rendant possible l’étude d’échantillons comportant des milliers d’autres substances. Cette approche a conduit aux immunodosages qui
ont pris un essor fabuleux en bénéficiant du développement du génie génétique et de la
biochimie.
Comme dans la méthode précédente, on mélange à l’échantillon contenant l’analyte,
une quantité connue de ce même analyte sous forme marquée à l’aide d’un radio-isotope
(fig. 17.1). Ensuite, pour isoler une fraction du mélange des deux formes, marquée et non
marquée, on ajoute un anticorps spécifique de ce composé afin de capter un peu des deux
formes. Elles seront dans le même rapport molaire qu’en solution. L’anticorps étant ajouté
en quantité substœchiométrique, on séparera le mélange complexé par précipitation avant
de procéder à son comptage.
La radio-immunologie — restée une méthode de choix pour certaines études de médecine clinique — a reçu peu d’applications pour le dosage des molécules de faible masses
© Dunod – La photocopie non autorisée est un délit