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Partie 1 • Méthodes séparatives
La figure 4.10a présente le schéma correspondant au passage d’un anion A
− en solution
dans un électrolyte typique d’une colonne anionique, au travers d’un suppresseur à membrane cationique.
Plus récemment sont apparus des suppresseurs autorégénérés par réaction électrolytique.
Ils comportent, soit une colonne spéciale contenant une résine régénérée par électrolyse, soit
un suppresseur à membrane dont les ions régénérants sont produits in situ par électrolyse
de l’eau. La figure 4.10b illustre le second procédé : il représente le passage d’un cation, en
solution dans de l’acide chlorhydrique dilué, au travers d’un suppresseur dont la membrane
est perméable aux anions.
En revanche, si le problème à résoudre est une séparation d’un mélange d’anions sur une
colonne anionique (garnissage cationique), avec un l’éluant contenant de la soude diluée,
on choisira une membrane perméable aux cations. Du côté cathodique, le passage des ions
hydroniums vers l’électrolyte fera disparaître les ions OH
− . Du côté de l’anode, ce sont les
ions Na
+ qui migreront et viendront réagir sur les ions OH
− .
4.6 ANALYSEURS D’ACIDES AMINÉS
La séparation et le dosage des mélanges d’acides aminés correspondent à une application
classique de la chromatographie ionique couplée à une méthode colorimétrique. Les acides
aminés ne pouvant être identifiés directement par absorption UV, on les fait réagir en sortie
de colonne sur la ninhydrine pour faire apparaître, quel que soit l’acide aminé, le même
dérivé coloré, aisément détectable par spectrophotométrie.
Le dosage des acides aminés apporte beaucoup d’informations particulièrement dans le
diagnostic de maladies. Ce sont les éléments constitutifs des protéines du règne vivant. Ils
existent également à l’état libre dans les liquides biologiques. Les échantillons de protéines
sont hydrolysés au moyen de HCl 6M vers 200
◦ C. Quant aux liquides biologiques, ils sont
déprotéinés par chauffage avec de l’acide sulfosalicylique.
Pour séparer les acides aminés les uns des autres on utilise un appareillage spécialisé qui
comporte une colonne cationique (polystyrène sulfoné) équilibrée avec une solution d’hydroxyde de lithium de façon à ce que les groupements acides sulfoniques soient sous forme
de sels de lithium (fig. 4.11). L’échantillon à doser étant porté à pH 2, les aminoacides, sous
forme cationique, déplacent les ions Li
+ de la phase stationnaire et s’y fixent plus ou moins
solidement en fonction de leur degré d’ionisation. L’élution se fait en augmentant progressivement le pH et les concentrations salines de la phase mobile. En sortie de colonne, ils sont
mélangés à un réactif contenant de la ninhydrine puis chauffés. Mis à part les acides aminés secondaires (type R-NH-R
), qui donnent une coloration jaune (détectée à 440 nm), les
acides aminés primaires (type R-NH 2 ) conduisent à la même coloration violette (détectée à
570 nm). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’acide aminé présente
dans le milieu réactionnel. Dans des conditions déterminées, le rapport d’absorption optique
570 nm/440 nm est caractéristique pour chaque acide aminé. La limite de détectabilité est
d’environ 30 picomoles.
Partie 1 • Méthodes séparatives
La figure 4.10a présente le schéma correspondant au passage d’un anion A
− en solution
dans un électrolyte typique d’une colonne anionique, au travers d’un suppresseur à membrane cationique.
Plus récemment sont apparus des suppresseurs autorégénérés par réaction électrolytique.
Ils comportent, soit une colonne spéciale contenant une résine régénérée par électrolyse, soit
un suppresseur à membrane dont les ions régénérants sont produits in situ par électrolyse
de l’eau. La figure 4.10b illustre le second procédé : il représente le passage d’un cation, en
solution dans de l’acide chlorhydrique dilué, au travers d’un suppresseur dont la membrane
est perméable aux anions.
En revanche, si le problème à résoudre est une séparation d’un mélange d’anions sur une
colonne anionique (garnissage cationique), avec un l’éluant contenant de la soude diluée,
on choisira une membrane perméable aux cations. Du côté cathodique, le passage des ions
hydroniums vers l’électrolyte fera disparaître les ions OH
− . Du côté de l’anode, ce sont les
ions Na
+ qui migreront et viendront réagir sur les ions OH
− .
4.6 ANALYSEURS D’ACIDES AMINÉS
La séparation et le dosage des mélanges d’acides aminés correspondent à une application
classique de la chromatographie ionique couplée à une méthode colorimétrique. Les acides
aminés ne pouvant être identifiés directement par absorption UV, on les fait réagir en sortie
de colonne sur la ninhydrine pour faire apparaître, quel que soit l’acide aminé, le même
dérivé coloré, aisément détectable par spectrophotométrie.
Le dosage des acides aminés apporte beaucoup d’informations particulièrement dans le
diagnostic de maladies. Ce sont les éléments constitutifs des protéines du règne vivant. Ils
existent également à l’état libre dans les liquides biologiques. Les échantillons de protéines
sont hydrolysés au moyen de HCl 6M vers 200
◦ C. Quant aux liquides biologiques, ils sont
déprotéinés par chauffage avec de l’acide sulfosalicylique.
Pour séparer les acides aminés les uns des autres on utilise un appareillage spécialisé qui
comporte une colonne cationique (polystyrène sulfoné) équilibrée avec une solution d’hydroxyde de lithium de façon à ce que les groupements acides sulfoniques soient sous forme
de sels de lithium (fig. 4.11). L’échantillon à doser étant porté à pH 2, les aminoacides, sous
forme cationique, déplacent les ions Li
+ de la phase stationnaire et s’y fixent plus ou moins
solidement en fonction de leur degré d’ionisation. L’élution se fait en augmentant progressivement le pH et les concentrations salines de la phase mobile. En sortie de colonne, ils sont
mélangés à un réactif contenant de la ninhydrine puis chauffés. Mis à part les acides aminés secondaires (type R-NH-R
), qui donnent une coloration jaune (détectée à 440 nm), les
acides aminés primaires (type R-NH 2 ) conduisent à la même coloration violette (détectée à
570 nm). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’acide aminé présente
dans le milieu réactionnel. Dans des conditions déterminées, le rapport d’absorption optique
570 nm/440 nm est caractéristique pour chaque acide aminé. La limite de détectabilité est
d’environ 30 picomoles.