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Annexe 1 :
Extraction et dosage des protéines
L’extraction et le dosage des protéines ont été effectués selon la méthode de référence « Kjeldahl ».
Principe
La détermination des protéines par la méthode Kjeldahl s’effectue en trois étapes :
- Digestion ou minéralisation de l’échantillon ;
- Distillation de l’ammoniac ;
- Titrage de l’ammoniac.
Mode opératoire
Minéralisation
La minéralisation permet de dénaturer les protéines (casser les liaisons) et de libérer les acides aminés,
ensuite transformer l’azote organique en azote minéral.
Elle est effectuée à l’aide d’un appareil de minéralisation « Inkjel » équipé d’une plaque chauffante, un
thermostat, un porte matras, un collecteur de fumées et un piégeur de fumées.
Dans un matras de Kjeldahl, on met :
-2g de l’aliment sec bien broyé (ou bien 2g de la chair de poisson lyophilisée), 7g de sulfate de sodium
Na2SO4, 5g de sélénium Se, et 1 ml de péroxyde d’hydrogène (H2O2) à 60% (10 vol), 10 ml d’acide
sulfurique concentré (H2SO4), et 2 à 3 petits morceaux de pierre ponce.
- On agite et on place le matras dans le dispositif de minéralisation.
- On chauffe doucement et progressivement jusqu’à l’apparition des fumées noires.
- On poursuit le chauffage durant 6h, jusqu’à l’obtention d’une couleur limpide. A la fin de la
minéralisation, on laisse les matras refroidir.
Filtration et dilution du minéralisat
- Apres refroidissement des matras, on filtre chaque minéralisat dans un erlenmeyer. On lave le matras et
on filtre aussi cette eau de rinçage.
- On ajuste à 100 ml avec l’eau distillé.
- On transvase les minéralisats filtrés et dilués dans les erlenmeyers colorés en brun à bouchon, étiquetés
et on les conserve au réfrigérateur à 4°C.
Distillation
- On prélève dans un matras de Kjeldahl 20 ml du minéralisat filtré et dilué pour la distillation. Ensuite on
place le matras dans l’appareil de distillation « Behr, Labor-Technik ».
- A l’aide d’un bouton on ajoute 40 ml de soude (NaOH) à 40% dans le matras et on débute la distillation.
- On recueille le distillat (ammoniaque entrainé à la vapeur) dans un erlenmeyer de collecte, contenant 20
ml d’acide borique à 4%, dont le pH a été préalablement déterminé.
Annexe 1 :
Extraction et dosage des protéines
L’extraction et le dosage des protéines ont été effectués selon la méthode de référence « Kjeldahl ».
Principe
La détermination des protéines par la méthode Kjeldahl s’effectue en trois étapes :
- Digestion ou minéralisation de l’échantillon ;
- Distillation de l’ammoniac ;
- Titrage de l’ammoniac.
Mode opératoire
Minéralisation
La minéralisation permet de dénaturer les protéines (casser les liaisons) et de libérer les acides aminés,
ensuite transformer l’azote organique en azote minéral.
Elle est effectuée à l’aide d’un appareil de minéralisation « Inkjel » équipé d’une plaque chauffante, un
thermostat, un porte matras, un collecteur de fumées et un piégeur de fumées.
Dans un matras de Kjeldahl, on met :
-2g de l’aliment sec bien broyé (ou bien 2g de la chair de poisson lyophilisée), 7g de sulfate de sodium
Na2SO4, 5g de sélénium Se, et 1 ml de péroxyde d’hydrogène (H2O2) à 60% (10 vol), 10 ml d’acide
sulfurique concentré (H2SO4), et 2 à 3 petits morceaux de pierre ponce.
- On agite et on place le matras dans le dispositif de minéralisation.
- On chauffe doucement et progressivement jusqu’à l’apparition des fumées noires.
- On poursuit le chauffage durant 6h, jusqu’à l’obtention d’une couleur limpide. A la fin de la
minéralisation, on laisse les matras refroidir.
Filtration et dilution du minéralisat
- Apres refroidissement des matras, on filtre chaque minéralisat dans un erlenmeyer. On lave le matras et
on filtre aussi cette eau de rinçage.
- On ajuste à 100 ml avec l’eau distillé.
- On transvase les minéralisats filtrés et dilués dans les erlenmeyers colorés en brun à bouchon, étiquetés
et on les conserve au réfrigérateur à 4°C.
Distillation
- On prélève dans un matras de Kjeldahl 20 ml du minéralisat filtré et dilué pour la distillation. Ensuite on
place le matras dans l’appareil de distillation « Behr, Labor-Technik ».
- A l’aide d’un bouton on ajoute 40 ml de soude (NaOH) à 40% dans le matras et on débute la distillation.
- On recueille le distillat (ammoniaque entrainé à la vapeur) dans un erlenmeyer de collecte, contenant 20
ml d’acide borique à 4%, dont le pH a été préalablement déterminé.