Chapitre II
Matériel et méthodes
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- Incubation 10 min a l’obscurité à température ambiante
- Lecture de la densité a optique à 540 nm
- Traçage de la droite DO=f ([BSA µg\ml])
- Détermination de la concentration de l’échantillon par extrapolation sur la courbe
d’étalonnage.
II.5.1.3 Dosage de l’activité catalase :
Principe : les catalases sont des enzymes qui interviennent dans la défense de la cellule contre le
stress oxydatif en éliminant les espèces réactives de l’oxygène n (ERO) et en accélérant la réaction
spontanée de dismutation du peroxyde d’hydrogène(H2O2) toxique pour la cellule en eau et en
oxygène. La technique utilisée est celle décrite par Clair borne (1985), elle consiste à suivre la
disparition de l’eau oxygénée par action de la catalase selon la réaction suivante :
CAT
2 H2O2
2 H2O + O2
- Suivie de l’activité enzymatique :
Dans les cuves en quartz, on introduit dans l’ordre :
Cuve 1
Blanc
-800µl de tampon (100mM, pH7) +
-200µl H2O2
-lire la DO a 240 nm et remettre le système du spectrophotomètre
à zéro
Cuve 2
Essai
-750µl de tampon (100mM, pH7) +
-200µl H2O2+
-50µl S9
-lire la DO à 0S,30S ,60S,90S,120s,150S,180S
-On suit la diminution de la densité optique par spectrophotomètre à une longueur d’onde 240nm
Détermination de l’activité CAT : l’activité spécifique de la catalase est exprimée en
µmole.min-1.mg-1 de protéines et est détermine à l’aide de la formule suivante :
Activité CAT(nmole.min-1.mg-1) = (Δ DO/ mn x1000) /(Ɛ*V*P)
Δ DO/ min = DO à T0s –DO àT60s
V : volume de l’échantillon en ml
P : mg de protéines par ml de la fraction à doser
Ɛ : coefficient d’extinction molaire de peroxyde d’hydrogène 0.04 M.cm-1
Eau oxygénée 100Mm :
300µl de H2O2 à 10 volumes concentré + 9700 µl de H2O