Chapitre II : Méthode d’identification
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Il convient d’éviter les séquences répétées inversées afin d’empêcher la formation de
structures secondaires dans l’amorce, ce qui empêcherait l’hybridation avec la matrice
(Somma, et al., 2006).
Les séquences complémentaires d’autres amorces utilisées dans la PCR devraient
également être évitées afin d’empêcher l’hybridation entre amorces ou la formation de
dimères d’amorce (particulièrement important pour l’extrémité 3’ de l’amorce). Si possible,
l’extrémité 3’ de l’amorce devrait être riche en bases de G et C pour une meilleure
hybridation de l’extrémité qui sera étendue(Somma, et al., 2006).
Des oligonucléotides sont généralement utilisés à la concentration de 1 μM dans la PCR, ce
qui est suffisant pour au moins 30 cycles d’amplification. Une concentration plus élevée
d’oligonucléotides peut entraîner l’amplification de séquences non cibles indésirables.
Inversement, la PCR est inefficace lorsque la concentration d’amorce est trop faible (Somma,
et al., 2006).
ADN polymérase
La Taq polymérase c’est une enzyme thermostable .Sa température optimale d’action
est de 72°C et elle est capable de résister à des passages successifs à 95°C, ce qui a rendu
possible l’automatisation de la procédure (Somma,et al.,2006).
La première ADN polymérase thermostable utilisée était l’ADN polymérase Taq,
isolée dans la bactérie Thermusaquaticus).Bien que cette enzyme soit probablement celle qui
est la plus largement utilisée dans les applications de la PCR, plusieurs autres ADN
polymérases sont commercialisés(Somma,et al., 2006).
En général, les ADN polymérases ne peuvent incorporer que des nucléotides de l’extrémité 3’
d’un polynucléotide avec une processivité de 50-60 nucléotides (nt) par seconde à
72°C(Somma,et al., 2006).
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Il convient d’éviter les séquences répétées inversées afin d’empêcher la formation de
structures secondaires dans l’amorce, ce qui empêcherait l’hybridation avec la matrice
(Somma, et al., 2006).
Les séquences complémentaires d’autres amorces utilisées dans la PCR devraient
également être évitées afin d’empêcher l’hybridation entre amorces ou la formation de
dimères d’amorce (particulièrement important pour l’extrémité 3’ de l’amorce). Si possible,
l’extrémité 3’ de l’amorce devrait être riche en bases de G et C pour une meilleure
hybridation de l’extrémité qui sera étendue(Somma, et al., 2006).
Des oligonucléotides sont généralement utilisés à la concentration de 1 μM dans la PCR, ce
qui est suffisant pour au moins 30 cycles d’amplification. Une concentration plus élevée
d’oligonucléotides peut entraîner l’amplification de séquences non cibles indésirables.
Inversement, la PCR est inefficace lorsque la concentration d’amorce est trop faible (Somma,
et al., 2006).
ADN polymérase
La Taq polymérase c’est une enzyme thermostable .Sa température optimale d’action
est de 72°C et elle est capable de résister à des passages successifs à 95°C, ce qui a rendu
possible l’automatisation de la procédure (Somma,et al.,2006).
La première ADN polymérase thermostable utilisée était l’ADN polymérase Taq,
isolée dans la bactérie Thermusaquaticus).Bien que cette enzyme soit probablement celle qui
est la plus largement utilisée dans les applications de la PCR, plusieurs autres ADN
polymérases sont commercialisés(Somma,et al., 2006).
En général, les ADN polymérases ne peuvent incorporer que des nucléotides de l’extrémité 3’
d’un polynucléotide avec une processivité de 50-60 nucléotides (nt) par seconde à
72°C(Somma,et al., 2006).