MATERIEL ET METHODES
30
A partir d’une culture jeune de 18-24h, des colonies ont été prélevées et déposées dans 5ml
d’eau physiologique stérile à raison d’une concentration de 10
8
(ajuster à une DO incluse
entre 0.08 et 0.1 à une longueur d’onde de 625nm). On procède ensuite à l'écouvillonnage par
stries serrées de chaque souche sur 2 boites de pétri contenant de la gélose MH à l’aide d’un
écouvillon stérile trempé dans la suspension bactérienne puis essoré. Les disques
d’antibiotiques sont ensuite déposés à 3cm d’écart les uns des autres sur les boîtes
préalablement ensemencées. Les boites sont incubées à 37° pendant 24h.
Les diamètres des zones d’inhibition de croissance autour de chaque disque ont été mesurés.
Les résultats sont interprétés selon les recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la
Société Française de Microbiologie CA-SFM (2017). Les résultats sont exprimés par (S)
sensible, (I) intermédiaire et (R) résistant.
II.2.6 Test d’hémolyse
A partir d’une culture jeune, un ensemencement en stries a été effectué sur des boîtes de
gélose Columbia contenant 5% de sang frais (humain) puis incubées pendant 24 h à 37°C.
Après incubation, on distingue l’α-hémolyse: halo transparent autour des colonies (hémolyse
totale), la β-hémolyse: halo verdâtre autour des colonies (hémolyse partielle) ou la Ɣ
hémolyse qui représente l’absence d’hémolyse (MARAGKOUDAKIS et al., 2006).
II.2.7 Test de la résistance au pH gastrique
Après revivification des souches test, 1 ml a été suspendu dans une solution de BHI bouillon
ajustée à pH 2, pH 3, pH 4 et pH 7 et incubée à 37°C (El-JENI et al., 2015). Après 3h
d’incubation, le taux de survie des bactéries dans les différents pH est estimé par un
dénombrement en surface fait à partir de plusieurs dilutions, accompagné par une mesure
comparative de la densité optique (à t=0 et t=3h) (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN,
2015). L’expérience a été faite en triplicata.
II.2.8 Test de la résistance aux sels biliaires
Après une revivification des souches test, 1 ml a été suspendu dans une solution de BHI
bouillon ajustée à pH 7 avec une concentration d’OXGAL de 0.3% et incubée à 37°C. (ElJENI et al. 2015). Après 3h d’incubation, le taux de survie des bactéries dans le bouillon de
BHI contenant les sels biliaires est estimé par un dénombrement en surface fait à partir de
plusieurs dilutions accompagné d’une mesure comparative de la densité optique. (A t=0 et
t=3h) (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN, 2015). L’expérience a été faite en triplicata.
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A partir d’une culture jeune de 18-24h, des colonies ont été prélevées et déposées dans 5ml
d’eau physiologique stérile à raison d’une concentration de 10
8
(ajuster à une DO incluse
entre 0.08 et 0.1 à une longueur d’onde de 625nm). On procède ensuite à l'écouvillonnage par
stries serrées de chaque souche sur 2 boites de pétri contenant de la gélose MH à l’aide d’un
écouvillon stérile trempé dans la suspension bactérienne puis essoré. Les disques
d’antibiotiques sont ensuite déposés à 3cm d’écart les uns des autres sur les boîtes
préalablement ensemencées. Les boites sont incubées à 37° pendant 24h.
Les diamètres des zones d’inhibition de croissance autour de chaque disque ont été mesurés.
Les résultats sont interprétés selon les recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la
Société Française de Microbiologie CA-SFM (2017). Les résultats sont exprimés par (S)
sensible, (I) intermédiaire et (R) résistant.
II.2.6 Test d’hémolyse
A partir d’une culture jeune, un ensemencement en stries a été effectué sur des boîtes de
gélose Columbia contenant 5% de sang frais (humain) puis incubées pendant 24 h à 37°C.
Après incubation, on distingue l’α-hémolyse: halo transparent autour des colonies (hémolyse
totale), la β-hémolyse: halo verdâtre autour des colonies (hémolyse partielle) ou la Ɣ
hémolyse qui représente l’absence d’hémolyse (MARAGKOUDAKIS et al., 2006).
II.2.7 Test de la résistance au pH gastrique
Après revivification des souches test, 1 ml a été suspendu dans une solution de BHI bouillon
ajustée à pH 2, pH 3, pH 4 et pH 7 et incubée à 37°C (El-JENI et al., 2015). Après 3h
d’incubation, le taux de survie des bactéries dans les différents pH est estimé par un
dénombrement en surface fait à partir de plusieurs dilutions, accompagné par une mesure
comparative de la densité optique (à t=0 et t=3h) (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN,
2015). L’expérience a été faite en triplicata.
II.2.8 Test de la résistance aux sels biliaires
Après une revivification des souches test, 1 ml a été suspendu dans une solution de BHI
bouillon ajustée à pH 7 avec une concentration d’OXGAL de 0.3% et incubée à 37°C. (ElJENI et al. 2015). Après 3h d’incubation, le taux de survie des bactéries dans le bouillon de
BHI contenant les sels biliaires est estimé par un dénombrement en surface fait à partir de
plusieurs dilutions accompagné d’une mesure comparative de la densité optique. (A t=0 et
t=3h) (MUTHUKUMAR et KANDEEPAN, 2015). L’expérience a été faite en triplicata.