MATÉRIELS ET MÉTHODES
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• Placer les tubes 24h au réfrigérateur (+4°C), sur un portoir recouvert de papier
aluminium, afin de protéger les échantillons de tout choc lumineux.
3.6.7.3.3 Mesure de la chlorophylle-a par le fluorimètre
3.6.7.3.3.1 Mesure du blanc
Le blanc constitué d’acétone à 90% est mesuré avant chaque série d’échantillon. Il permet de
régler le zéro de l’appareil.
3.6.7.3.3.2 Mesure de la fluorescence des échantillons
• Sortir les tubes du réfrigérateur. Agiter les tubes.
• Centrifuger 5 min à 3000 tours/min de préférence dans une centrifugeuse réfrigérée à
+4°C.
• Remettre en suspension les morceaux de filtre qui se sont déposés sur les parois du tube.
• Centrifuger à nouveau 10 min.
• Prélever alors le surnageant et le transférer dans un tube de mesure. Mesurer la
fluorescence F0.
• Rajouter entre 10 et 20µl d’HCl 0,3N par ml d’extrait. Agiter et mesurer la fluorescence
Fa quand le signal est stable (1 à 5 minutes après l’ajout d’acide)
3.6.7.3.4 Détermination de la droite d’étalonnage
3.6.7.3.4.1 Détermination de la concentration de la solution-mère de chlorophylle a par
spectrophotométrie
• Diluer le contenu de l’ampoule de chlorophylle-a (chlorophyll a from Spinach 1mg ;
ref C-5753 chez Sigma-Aldrich). dans 100ml d’acétone à 90% ;
• Diluer 20 fois cette solution 5ml de la solution mère + 95ml d’acétone à 90%
Régler le zéro du spectrophotomètre avec l’acétone à 90% ;
• Vérifier la pureté de la solution de chlorophylle a en effectuant un spectre d’absorption
entre 700 nm et 400nm. Les pics d’absorption doivent se situer à 432nm et 664 nm. Et
Vérifier également que le spectre ne présente pas le moindre léger pic à 505 nm. Sinon,
il y a contamination par la phéophytine ;
• Si la solution est pure, mesurer la densité optique (D0) de la solution à 664 nm
En déduire la concentration réelle de la solution (équation de Beer-Lambert) ;
𝐷0 = 𝜀 × í µí°¿ × í µí°¶ 30