12.3.4 Conclusions and Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573
12.3.4.1 Solution Properties of the Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573
12.3.4.2 Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 574
12.3.4.3 Perspectives, Suggestions, and Speculations . . . . . . . . . . . . . . 577
12.4 Protocol 12.1: Preparation of Amphipol-Trapped Membrane Proteins
for Cryo-EM Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579
12.4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579
12.4.2 Vectors and Cell Lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580
12.4.3 Buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580
12.4.4 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 581
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583
13 Amphipol-Mediated Immobilization of Membrane Proteins and Its Applications . . . 591
13.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 591
13.2 Immobilization of Membrane Proteins Using Biotinylated Amphipols
and Its Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595
13.2.1 Validation of the Approach Using Biotinylated A8-35 . . . . . . . . . . . . . . 595
13.2.2 Multiplexing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 600
13.2.3 Using Ionic vs. Non-ionic Biotinylated Amphipols for Phage
Display Selection of Membrane Protein Binders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 604
13.3 Alternative Tags . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 607
13.3.1 Polyhistidine-Tagged A8-35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 608
13.3.2 Imidazole-Tagged Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 611
13.3.3 Oligonucleotide-Tagged Amphipol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613
13.3.4 Sulfide- and Sulfhydryl-Tagged Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 615
13.4 Other Applications of Tagged Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 616
13.5 Protocol 13.1. Amphipol-Mediated Immobilization of Membrane
Proteins for Surface Plasmon Resonance Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617
13.5.1 Experimental Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617
13.5.2 Preparation of Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618
13.5.3 Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619
14 The Use of Amphipols in Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625
14.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625
14.2 MALDI-TOF Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 633
14.3 Electrospray Ionization-Mass Spectrometry Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 636
14.3.1 Membrane Protein/Amphipol Complexes Are Amenable
to Electrospray Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 636
14.3.2 Amphipols, ESI-MS, and Oligomeric Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . 640
14.3.3 Interactions of Detergents vs. Amphipols with Membrane
Proteins as Probed by Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 641
14.3.4 Can Amphipols Better Suited to ESI-MS Be Developed? . . . . . . . . . . . . 643
14.4 Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 644
14.5 Protocol 14.1: Characterization of Amphipol-Trapped Membrane Proteins
by Electrospray Ionization-Ion Mobility Spectrometry-Mass Spectrometry . . . . . . 648
14.5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 648
14.5.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 648
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Contents
12.3.4.1 Solution Properties of the Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573
12.3.4.2 Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 574
12.3.4.3 Perspectives, Suggestions, and Speculations . . . . . . . . . . . . . . 577
12.4 Protocol 12.1: Preparation of Amphipol-Trapped Membrane Proteins
for Cryo-EM Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579
12.4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 579
12.4.2 Vectors and Cell Lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580
12.4.3 Buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580
12.4.4 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 581
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583
13 Amphipol-Mediated Immobilization of Membrane Proteins and Its Applications . . . 591
13.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 591
13.2 Immobilization of Membrane Proteins Using Biotinylated Amphipols
and Its Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595
13.2.1 Validation of the Approach Using Biotinylated A8-35 . . . . . . . . . . . . . . 595
13.2.2 Multiplexing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 600
13.2.3 Using Ionic vs. Non-ionic Biotinylated Amphipols for Phage
Display Selection of Membrane Protein Binders . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 604
13.3 Alternative Tags . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 607
13.3.1 Polyhistidine-Tagged A8-35 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 608
13.3.2 Imidazole-Tagged Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 611
13.3.3 Oligonucleotide-Tagged Amphipol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613
13.3.4 Sulfide- and Sulfhydryl-Tagged Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 615
13.4 Other Applications of Tagged Amphipols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 616
13.5 Protocol 13.1. Amphipol-Mediated Immobilization of Membrane
Proteins for Surface Plasmon Resonance Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617
13.5.1 Experimental Setup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 617
13.5.2 Preparation of Samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618
13.5.3 Measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619
14 The Use of Amphipols in Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625
14.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625
14.2 MALDI-TOF Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 633
14.3 Electrospray Ionization-Mass Spectrometry Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 636
14.3.1 Membrane Protein/Amphipol Complexes Are Amenable
to Electrospray Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 636
14.3.2 Amphipols, ESI-MS, and Oligomeric Membrane Proteins . . . . . . . . . . . . 640
14.3.3 Interactions of Detergents vs. Amphipols with Membrane
Proteins as Probed by Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 641
14.3.4 Can Amphipols Better Suited to ESI-MS Be Developed? . . . . . . . . . . . . 643
14.4 Proteomics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 644
14.5 Protocol 14.1: Characterization of Amphipol-Trapped Membrane Proteins
by Electrospray Ionization-Ion Mobility Spectrometry-Mass Spectrometry . . . . . . 648
14.5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 648
14.5.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 648
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Contents