xiv
Contents
2.4.5 Crystallization and Data Collection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.4.6 Structure Determination and Refinement . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4.7 Computational Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4.8 Molecular Cloning, Protein Expression,
and Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.4.9 Fluorescence Polarization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.4.10 Cell Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.4.11 Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.4.12 Serum Stability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Appendix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3 In-Tether Chiral Center Induced Helical Peptide Modulators
Target p53-MDM2/MDMX and Inhibit Tumor Growth
in Cancer Stem Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.1 MeR/PhR Is a Dual Inhibitor of MDM2 and MDMX
and Exhibits Cell Nucleus Accumulation . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.2 MeR/PhR Activates P53 Signaling in Cancer Cells . . . . . . . 71
3.2.3 MeR/PhR Reactivates Major P53 Cellular Functions
in Cancer Cells that Overexpress MDM2 and MDMX . . . . 77
3.2.4 PhR Peptide Upregulates P53 and Induces Cell
Apoptosis in a Time-Dependent Manner . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.5 Transcriptome Analysis of PhR-Treated Cells . . . . . . . . . . . 82
3.2.6 PhR Suppresses Tumor Growth in Vivo in PA-1
Xenograft Model via Reactivation of the P53 Pathway . . . . 82
3.2.7 PhR Shows High Biocompatibility and Low Toxicity
in Vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.3 Discussion and Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.4 Methods and Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.1 Peptide Synthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.2 Protein Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.3 Fluorescence Polarization Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.4 Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.4.5 Confocal Microscopy and Co-localization Assay . . . . . . . . 93
3.4.6 Cell Viability Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.7 Western Blot Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.8 RNA Extraction and RT-PCR and Microarray
Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.9 Ubiquitination Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.4.10 Preparation of Paraffin Section Histological Analysis
(IHC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3.4.11 Antitumor Efficacy in Human Xenograft Model
Using PhR Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
Contents
2.4.5 Crystallization and Data Collection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.4.6 Structure Determination and Refinement . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4.7 Computational Studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4.8 Molecular Cloning, Protein Expression,
and Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.4.9 Fluorescence Polarization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
2.4.10 Cell Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.4.11 Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.4.12 Serum Stability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
Appendix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3 In-Tether Chiral Center Induced Helical Peptide Modulators
Target p53-MDM2/MDMX and Inhibit Tumor Growth
in Cancer Stem Cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2 Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.1 MeR/PhR Is a Dual Inhibitor of MDM2 and MDMX
and Exhibits Cell Nucleus Accumulation . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.2 MeR/PhR Activates P53 Signaling in Cancer Cells . . . . . . . 71
3.2.3 MeR/PhR Reactivates Major P53 Cellular Functions
in Cancer Cells that Overexpress MDM2 and MDMX . . . . 77
3.2.4 PhR Peptide Upregulates P53 and Induces Cell
Apoptosis in a Time-Dependent Manner . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2.5 Transcriptome Analysis of PhR-Treated Cells . . . . . . . . . . . 82
3.2.6 PhR Suppresses Tumor Growth in Vivo in PA-1
Xenograft Model via Reactivation of the P53 Pathway . . . . 82
3.2.7 PhR Shows High Biocompatibility and Low Toxicity
in Vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
3.3 Discussion and Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
3.4 Methods and Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.1 Peptide Synthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.2 Protein Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.3 Fluorescence Polarization Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.4.4 Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.4.5 Confocal Microscopy and Co-localization Assay . . . . . . . . 93
3.4.6 Cell Viability Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.7 Western Blot Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.8 RNA Extraction and RT-PCR and Microarray
Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.9 Ubiquitination Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.4.10 Preparation of Paraffin Section Histological Analysis
(IHC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3.4.11 Antitumor Efficacy in Human Xenograft Model
Using PhR Peptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96