Matériel et Méthodes
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Des colonies bactériennes résistantes aux métaux lourds ont subi une série de
repiquage sur milieu contenant les mêmes métaux lourds afin de les purifier et de
confirmer leur résistance avant de les conserver. Les cultures pures ont été
conservées dans des tubes de conservation.
II.6-Identification des bactéries résistantes
L’identification des bactéries résistantes conservées s’est basée selon le cas sur les
tests suivants :
II.6.1- La coloration de GRAM :
La coloration de Gram permet de déterminer deux grands groupes bactériens (Gram
positif et Gram négatif), elle nous permet aussi de reconnaitre la morphologie et le
mode de regroupement des bactéries, les étapes de la méthode sont comme suit
(Joffin et Leyral 2006) :
* Préparation du frottis bactérien : Prélever une jeune colonie bactérienne (de 1824h) à identifier et l’étaler sur une goutte d’eau à l’aide d’une anse de platine puis la
fixer par simple passage sur la flamme du bec bensun.
* Coloration au Violet de Gentiane: Chaque frottis fixé est coloré pendant une
minute au Violet de Gentiane puis laver à l’eau courante.
*Mordançage : Traiter durant une minute à une minute et demi la lame par une
solution de Lugol, puis laver à l’eau courante.
*Décoloration: Faire couler l’alcool durant 10 secondes sur la lame puis laver
immédiatement à l’eau courante. À ce stade les cellules à Gram négatif seront
incolores, les cellules à Gram positif restent violettes.
* Recoloration: en rajoutant de la fuchsine pendant 1 min, puis rincer et sécher la
lame.
* Lecture : Examiner le frottis au microscope optique en ajoutant une goutte d’huile
à immersion (au Gx100). Les bactéries à Gram positif sont colorées en violet alors
que les bactéries à Gram négatif sont colorées en rose. Celles-ci diffèrent de part la
composition de leur paroi, notamment par l’épaisseur du peptidoglycane ou de la
présence d’une paroi externe. Cette coloration nous permet également de définir la
forme et l’arrangement des cellules bactériennes.
II.6.2-Identification biochimique des bacilles à Gram négatif : Galerie API20E
Après confirmation du GRAM, les souches à GRAM négatif de forme bacille ou
cocobacille ont été identifiées au moyen de galerie API20E (BioMérieux, Inc.
France)
*La galerie Api20E : Est un système pour l’identification des entérobactéries et
autres bacilles à Gram négatif, elle comporte 20 micro tubes contenant des substrats
déshydratées. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui
reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se
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Des colonies bactériennes résistantes aux métaux lourds ont subi une série de
repiquage sur milieu contenant les mêmes métaux lourds afin de les purifier et de
confirmer leur résistance avant de les conserver. Les cultures pures ont été
conservées dans des tubes de conservation.
II.6-Identification des bactéries résistantes
L’identification des bactéries résistantes conservées s’est basée selon le cas sur les
tests suivants :
II.6.1- La coloration de GRAM :
La coloration de Gram permet de déterminer deux grands groupes bactériens (Gram
positif et Gram négatif), elle nous permet aussi de reconnaitre la morphologie et le
mode de regroupement des bactéries, les étapes de la méthode sont comme suit
(Joffin et Leyral 2006) :
* Préparation du frottis bactérien : Prélever une jeune colonie bactérienne (de 1824h) à identifier et l’étaler sur une goutte d’eau à l’aide d’une anse de platine puis la
fixer par simple passage sur la flamme du bec bensun.
* Coloration au Violet de Gentiane: Chaque frottis fixé est coloré pendant une
minute au Violet de Gentiane puis laver à l’eau courante.
*Mordançage : Traiter durant une minute à une minute et demi la lame par une
solution de Lugol, puis laver à l’eau courante.
*Décoloration: Faire couler l’alcool durant 10 secondes sur la lame puis laver
immédiatement à l’eau courante. À ce stade les cellules à Gram négatif seront
incolores, les cellules à Gram positif restent violettes.
* Recoloration: en rajoutant de la fuchsine pendant 1 min, puis rincer et sécher la
lame.
* Lecture : Examiner le frottis au microscope optique en ajoutant une goutte d’huile
à immersion (au Gx100). Les bactéries à Gram positif sont colorées en violet alors
que les bactéries à Gram négatif sont colorées en rose. Celles-ci diffèrent de part la
composition de leur paroi, notamment par l’épaisseur du peptidoglycane ou de la
présence d’une paroi externe. Cette coloration nous permet également de définir la
forme et l’arrangement des cellules bactériennes.
II.6.2-Identification biochimique des bacilles à Gram négatif : Galerie API20E
Après confirmation du GRAM, les souches à GRAM négatif de forme bacille ou
cocobacille ont été identifiées au moyen de galerie API20E (BioMérieux, Inc.
France)
*La galerie Api20E : Est un système pour l’identification des entérobactéries et
autres bacilles à Gram négatif, elle comporte 20 micro tubes contenant des substrats
déshydratées. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui
reconstitue les milieux. Les réactions produites pendant la période d’incubation se