Nouveaux outils de détection et d’ analyse
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2.2.1. Fractionnement du protéome
2.2.1.1 . L’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE)
Apparue dans les années 1970, l’électrophorèse bidimensionnelle est la technique historique de référence pour séparer les protéines avant leur identification
en spectrométrie de masse (Gorg et al., 2004). Cette technique comporte deux
étapes successives : la séparation des protéines par leur point isoélectrique, puis
par leur masse moléculaire. Les spots ainsi séparés sont visualisés par coloration
en utilisant le bleu de Coomassie, le nitrate d’argent ou des composés fluorescents. L’amélioration technique apportée il y a quelques années par la 2-D DIGE
(2-D fluorescence difference gel electrophoresis) permet l’analyse différentielle
sur un seul gel sur lequel est déposé le mélange des échantillons à comparer, préalablement marqués chacun avec une cyanine différente. L’intensité comparée au
sein du même spot des deux signaux fluorescents permet de mettre en évidence
la différence d’abondance d’une même protéine dans les deux échantillons. Cette
technique permet de bénéficier de la sensibilité du signal fluorescent et d’améliorer la reproductibilité des analyses. Après visualisation des taches, l’analyse
de différences entre échantillons témoins et exposés au toxique se fait à l’aide de
logiciels d’analyse d’images (SameSpot, ImageMaster). Les spots sélectionnés
sont ensuite découpés puis les protéines de chaque spot sont digérées avec de la
trypsine (une endopeptidase clivant la chaîne peptidique après Arg, Lys).
Certaines classes de protéines sont moins accessibles avec la 2-DE : les
protéines hydrophobes (les protéines membranaires), les protéines très basiques
et celles de masse moléculaire < 5 kDa ou > 100 kDa. La 2-DE a également une
résolution et une sensibilité limitées. La détection des protéines minoritaires est
un vrai problème quand il y a une grande différence d abondance entie protéines
dans un échantillon (sérum, liquide bronchique alvéolaire). Ce problème peut
être contourné par l’utilisation en amont de diverses techniques de préfractionnement comme la chromatographie d’affinité qui permet de retirer jusqu à
quatorze protéines sériques majoritaires (MARS-14, Agilent), 1 utilisation de
billes couplées à des hexapeptides (Proteominer, Biorad) pour niveler la dynamique d’un protéome ou enfin l’enrichissement en protéines minoritaires par
exemple phosphorylées à l’aide des supports de métaux immobilisés.
g
§
2.2.1.2. Les autres approches
|
Des alternatives plus performantes que la 2-DE émergent depuis quelques
। années. La chromatographie liquide simple ou combinée (Mudpit) permet de
ç ’épartir les protéines ou les peptides en fonction d une caractéristique biochi
s mique (hydrophobicité, charge...). Une telle séparation se fait aussi sur des
| supports solides comme dans la technique SELD1 qui très répandue dans le
I domaine de la recherche de biomarqueurs car elle bénéficie d un débit élevé et
” permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons.
:
Le simple gel SDS-PAGE est aussi utilisé comme étape préliminaire de frac5 bonnement, chaque piste du gel étant découpée en plusieurs tranches ensuite
hydrolysées par la trypsine et analysées.
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2.2.1. Fractionnement du protéome
2.2.1.1 . L’électrophorèse bidimensionnelle (2-DE)
Apparue dans les années 1970, l’électrophorèse bidimensionnelle est la technique historique de référence pour séparer les protéines avant leur identification
en spectrométrie de masse (Gorg et al., 2004). Cette technique comporte deux
étapes successives : la séparation des protéines par leur point isoélectrique, puis
par leur masse moléculaire. Les spots ainsi séparés sont visualisés par coloration
en utilisant le bleu de Coomassie, le nitrate d’argent ou des composés fluorescents. L’amélioration technique apportée il y a quelques années par la 2-D DIGE
(2-D fluorescence difference gel electrophoresis) permet l’analyse différentielle
sur un seul gel sur lequel est déposé le mélange des échantillons à comparer, préalablement marqués chacun avec une cyanine différente. L’intensité comparée au
sein du même spot des deux signaux fluorescents permet de mettre en évidence
la différence d’abondance d’une même protéine dans les deux échantillons. Cette
technique permet de bénéficier de la sensibilité du signal fluorescent et d’améliorer la reproductibilité des analyses. Après visualisation des taches, l’analyse
de différences entre échantillons témoins et exposés au toxique se fait à l’aide de
logiciels d’analyse d’images (SameSpot, ImageMaster). Les spots sélectionnés
sont ensuite découpés puis les protéines de chaque spot sont digérées avec de la
trypsine (une endopeptidase clivant la chaîne peptidique après Arg, Lys).
Certaines classes de protéines sont moins accessibles avec la 2-DE : les
protéines hydrophobes (les protéines membranaires), les protéines très basiques
et celles de masse moléculaire < 5 kDa ou > 100 kDa. La 2-DE a également une
résolution et une sensibilité limitées. La détection des protéines minoritaires est
un vrai problème quand il y a une grande différence d abondance entie protéines
dans un échantillon (sérum, liquide bronchique alvéolaire). Ce problème peut
être contourné par l’utilisation en amont de diverses techniques de préfractionnement comme la chromatographie d’affinité qui permet de retirer jusqu à
quatorze protéines sériques majoritaires (MARS-14, Agilent), 1 utilisation de
billes couplées à des hexapeptides (Proteominer, Biorad) pour niveler la dynamique d’un protéome ou enfin l’enrichissement en protéines minoritaires par
exemple phosphorylées à l’aide des supports de métaux immobilisés.
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2.2.1.2. Les autres approches
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Des alternatives plus performantes que la 2-DE émergent depuis quelques
। années. La chromatographie liquide simple ou combinée (Mudpit) permet de
ç ’épartir les protéines ou les peptides en fonction d une caractéristique biochi
s mique (hydrophobicité, charge...). Une telle séparation se fait aussi sur des
| supports solides comme dans la technique SELD1 qui très répandue dans le
I domaine de la recherche de biomarqueurs car elle bénéficie d un débit élevé et
” permet l’analyse d’un grand nombre d’échantillons.
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Le simple gel SDS-PAGE est aussi utilisé comme étape préliminaire de frac5 bonnement, chaque piste du gel étant découpée en plusieurs tranches ensuite
hydrolysées par la trypsine et analysées.