Biologie structurale des interactions entre protéines et éléments d’intérêt
11 n’existe pas à ce jour de lentilles capables de refocaliser les RX et il est donc
impossible d’appliquer directement le principe du microscope pour la visualisation des atomes. La solution consiste à s’affranchir de lentilles par un traitement
mathématique du signal basé sur la transformée de Fourier. Cependant l’intensité
de la lumière diffusée par une molécule isolée est trop faible pour être analysée.
L’amplification du signal est obtenue en soumettant simultanément au rayonnement un grand nombre de molécules empilées de manière périodique et constituant un cristal de protéine. Le signal enregistré correspond alors à l’amplitude
de l’ensemble des ondes diffractées par le cristal, les phases étant perdues. Or la
structure de la protéine (et plus particulièrement la densité électronique au sein
du cristal) est reliée par transformée de Fourier à l’amplitude et à la phase de
fonde diffractée. Des méthodes indirectes sont donc nécessaires pour déterminer
les phases perdues. Le remplacement moléculaire est utilisé quand on dispose
d’une structure cristalline proche de la structure à déterminer (typiquement plus
de 25 % d’identité de séquence) à partir de laquelle les phases sont estimées. La
deuxième méthode consiste à introduire un atome lourd au sein de la molécule
native soit par trempage direct du cristal soit par marquage de la protéine (sous
forme de sélénométhionine par exemple). Les spectres de diffraction du cristal
de protéine contenant l’atome lourd sont alors enregistrés à plusieurs longueurs
d’onde, en général autour d’un seuil d’absorption X du métal, permettant ainsi
d’extraire les phases issues de la molécule native.
La détermination de la structure tridimensionnelle d’une protéine nécessite
donc plusieurs étapes : la première consiste à cristalliser la macromolécule purifiée, puis à la soumettre aux RX (le plus souvent sous une source synchrotron
puissante), à enregistrer l’amplitude des ondes diffractées par le cristal, à déterminer la phase de ces ondes afin d’obtenir par la transformation de Fourier la
densité électronique expérimentale dans laquelle il sera possible de construire le
modèle atomique.
1.2. Méthodes spectroscopiques
1.2.1. Les spectroscopies UV-visible et de fluorescence
Les spectroscopies UV-Vis et de fluorescence sont classiquement utilisées
pour une première analyse des sites métalliques et permettent de déterminer des
constantes de dissociation conditionnelles du métal pour la protéine.
Les spectres d’absorption dans le domaine UV-Vis renseignent sur les
propriétés électroniques des sites métalliques et sur la présence de certains
ligands (tyrosine ou cystéine) donnant lieu à des bandes de transfert de charge
avec le métal. De même, l’ajout progressif du métal dans une solution de protéines
peut provoquer des variations de fluorescence d’acides aminés aromatiques situés
à proximité du site de fixation du métal.
11 n’existe pas à ce jour de lentilles capables de refocaliser les RX et il est donc
impossible d’appliquer directement le principe du microscope pour la visualisation des atomes. La solution consiste à s’affranchir de lentilles par un traitement
mathématique du signal basé sur la transformée de Fourier. Cependant l’intensité
de la lumière diffusée par une molécule isolée est trop faible pour être analysée.
L’amplification du signal est obtenue en soumettant simultanément au rayonnement un grand nombre de molécules empilées de manière périodique et constituant un cristal de protéine. Le signal enregistré correspond alors à l’amplitude
de l’ensemble des ondes diffractées par le cristal, les phases étant perdues. Or la
structure de la protéine (et plus particulièrement la densité électronique au sein
du cristal) est reliée par transformée de Fourier à l’amplitude et à la phase de
fonde diffractée. Des méthodes indirectes sont donc nécessaires pour déterminer
les phases perdues. Le remplacement moléculaire est utilisé quand on dispose
d’une structure cristalline proche de la structure à déterminer (typiquement plus
de 25 % d’identité de séquence) à partir de laquelle les phases sont estimées. La
deuxième méthode consiste à introduire un atome lourd au sein de la molécule
native soit par trempage direct du cristal soit par marquage de la protéine (sous
forme de sélénométhionine par exemple). Les spectres de diffraction du cristal
de protéine contenant l’atome lourd sont alors enregistrés à plusieurs longueurs
d’onde, en général autour d’un seuil d’absorption X du métal, permettant ainsi
d’extraire les phases issues de la molécule native.
La détermination de la structure tridimensionnelle d’une protéine nécessite
donc plusieurs étapes : la première consiste à cristalliser la macromolécule purifiée, puis à la soumettre aux RX (le plus souvent sous une source synchrotron
puissante), à enregistrer l’amplitude des ondes diffractées par le cristal, à déterminer la phase de ces ondes afin d’obtenir par la transformation de Fourier la
densité électronique expérimentale dans laquelle il sera possible de construire le
modèle atomique.
1.2. Méthodes spectroscopiques
1.2.1. Les spectroscopies UV-visible et de fluorescence
Les spectroscopies UV-Vis et de fluorescence sont classiquement utilisées
pour une première analyse des sites métalliques et permettent de déterminer des
constantes de dissociation conditionnelles du métal pour la protéine.
Les spectres d’absorption dans le domaine UV-Vis renseignent sur les
propriétés électroniques des sites métalliques et sur la présence de certains
ligands (tyrosine ou cystéine) donnant lieu à des bandes de transfert de charge
avec le métal. De même, l’ajout progressif du métal dans une solution de protéines
peut provoquer des variations de fluorescence d’acides aminés aromatiques situés
à proximité du site de fixation du métal.