CHAPITRE II MATERIEL ET METHODES
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II.5.1. Extraction et quantification des sucres soluble (COSTA et al., 2016 ; BURKE et al.,
1996)
L’analyse des sucres nécessite leur extraction préalable. Les 60 à 100 mg de tissus frais de feuille
ou de rhizome prélevés lors de la dissection des faisceaux ont été broyés à l’azote liquide. Le
broyat a été extrait dans 10 ml d’éthanol 80 % pendant 30 minutes au bain-marie à 80°C, avec
agitation avant, pendant et après incubation. Les extraits ont par la suite été centrifugés à 2 000
tr/min pendant 5 minutes. Le surnageant fut récupéré pour la détermination des sucres solubles et
le culot congelé avec le minimum de liquide pour l’extraction et la quantification subséquente de
l’amidon. Si on ne procède pas à l’analyse des sucres solubles dans la foulée de leur extraction (le
cas dans le présent travail), le surnageant (éthanol et sucres) peut être congelé (-20°C).
Comme l’éthanol est un bon solvant pour les pigments photosynthétiques (SARTORY et
GROBBELAAR, 1984), tous les échantillons ont été traités au charbon actif avant lecture
d'absorbance au spectrophotomètre afin d’éviter toute interférence. Deux-cents mg de charbon
actif en poudre ont donc été ajoutés aux 10 ml d’extrait, agité pendant 2 h puis centrifugés pendant
8 min à 5 000 tr/min. Le surnageant fut récupéré pour le dosage des sucres solubles. Les sucres
solubles ont été quantifiés par spectrophotométrie par la méthode phénol-acide sulfurique. Le
traitement des sucres solubles avec du phénol et de l’acide sulfurique résulte en une couleur
orange-jaune, stable pendant plusieurs heures, dont l’absorbance a 490 nm est proportionnelle à la
concentration en sucres (DUBOIS et al., 1956).
Une série de dilutions standards allant de 0 à 90 µg de glucose par ml ont été préparées à partir
d'une solution mère de glucose (10 mg glucose dans 100 ml d'eau ultrapure ; arium®pro ultrapure
water systems, Sartorius AG, Germany). Les concentrations sont exprimées en mg glucose
équivalent par gPS (gramme de poids sec) de tissus. Les extraits de sucres solubles ont été dilués 2
fois pour les feuilles et 10 fois pour les rhizomes de manière à se situer dans la gamme des
concentrations de la droite étalon (établie selon le protocole adapté par COSTA et al., (2016) pour
le dosage des sucres solubles dans les feuilles de P. oceanica, pour une biomasse de tissu extraite
de 60 mg). Un ml de chaque solution standard et d’échantillon dilué a été mis dans un tube avec,
dans un premier temps, 1 ml de phénol 5 % suivi immédiatement par l'ajout de 5 ml d’acide
sulfurique concentré (95.5 %). Les tubes ont ensuite été vortexés, laissés à reposer pendant 10
minutes puis vortexés à nouveau. On a laissé la coloration se développer pendant 30 minutes avant
de procéder à la lecture d'absorbance à 490 nm par spectrophotométrie.
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II.5.1. Extraction et quantification des sucres soluble (COSTA et al., 2016 ; BURKE et al.,
1996)
L’analyse des sucres nécessite leur extraction préalable. Les 60 à 100 mg de tissus frais de feuille
ou de rhizome prélevés lors de la dissection des faisceaux ont été broyés à l’azote liquide. Le
broyat a été extrait dans 10 ml d’éthanol 80 % pendant 30 minutes au bain-marie à 80°C, avec
agitation avant, pendant et après incubation. Les extraits ont par la suite été centrifugés à 2 000
tr/min pendant 5 minutes. Le surnageant fut récupéré pour la détermination des sucres solubles et
le culot congelé avec le minimum de liquide pour l’extraction et la quantification subséquente de
l’amidon. Si on ne procède pas à l’analyse des sucres solubles dans la foulée de leur extraction (le
cas dans le présent travail), le surnageant (éthanol et sucres) peut être congelé (-20°C).
Comme l’éthanol est un bon solvant pour les pigments photosynthétiques (SARTORY et
GROBBELAAR, 1984), tous les échantillons ont été traités au charbon actif avant lecture
d'absorbance au spectrophotomètre afin d’éviter toute interférence. Deux-cents mg de charbon
actif en poudre ont donc été ajoutés aux 10 ml d’extrait, agité pendant 2 h puis centrifugés pendant
8 min à 5 000 tr/min. Le surnageant fut récupéré pour le dosage des sucres solubles. Les sucres
solubles ont été quantifiés par spectrophotométrie par la méthode phénol-acide sulfurique. Le
traitement des sucres solubles avec du phénol et de l’acide sulfurique résulte en une couleur
orange-jaune, stable pendant plusieurs heures, dont l’absorbance a 490 nm est proportionnelle à la
concentration en sucres (DUBOIS et al., 1956).
Une série de dilutions standards allant de 0 à 90 µg de glucose par ml ont été préparées à partir
d'une solution mère de glucose (10 mg glucose dans 100 ml d'eau ultrapure ; arium®pro ultrapure
water systems, Sartorius AG, Germany). Les concentrations sont exprimées en mg glucose
équivalent par gPS (gramme de poids sec) de tissus. Les extraits de sucres solubles ont été dilués 2
fois pour les feuilles et 10 fois pour les rhizomes de manière à se situer dans la gamme des
concentrations de la droite étalon (établie selon le protocole adapté par COSTA et al., (2016) pour
le dosage des sucres solubles dans les feuilles de P. oceanica, pour une biomasse de tissu extraite
de 60 mg). Un ml de chaque solution standard et d’échantillon dilué a été mis dans un tube avec,
dans un premier temps, 1 ml de phénol 5 % suivi immédiatement par l'ajout de 5 ml d’acide
sulfurique concentré (95.5 %). Les tubes ont ensuite été vortexés, laissés à reposer pendant 10
minutes puis vortexés à nouveau. On a laissé la coloration se développer pendant 30 minutes avant
de procéder à la lecture d'absorbance à 490 nm par spectrophotométrie.