Chapitre III : MATERIELS ET METHODES
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• Centrifuger 10min à 3500 tours/min.
• Remettre en suspension les morceaux de filtre qui se sont déposés sur les parois du
tube ;
• Centrifuger à nouveau 5 min ;
• Prélever alors le surnageant et le transférer dans un tube de mesure.
• Mesurer l’intensité fluorescenceIF.
2.4.3.3.4.1 Détermination de la gamme d’étalonnage
 Détermination de la concentration de la solution-mère de chlorophylle "a " par
spectrophotométrie :
• Diluer le contenu de l’ampoule de chlorophylleʺ a "(référence) dans 100ml d’acétone à
90% ;
• Diluer 20 fois cette solution: 5ml de la solution mère + 95ml d’acétone à 90% ;
• Régler le zéro du spectrophotomètre avec l’acétone à 90% ;
• Vérifier la pureté de la solution de chlorophylle "a" en effectuant un spectre
d’absorption entre 700 nm et 400nm. Les pics d’absorption doivent se situer à 432 nm
et 664 nm. On doit bien entendu éviter la contamination par la phéophytine a. et
Vérifier que le spectre ne présente pas le moindre léger pic à 505 nm. Sinon, il y a
contamination par la phéophytine et la solution ne peut pas être utilisée comme
standard ;
• Si la solution est pure, mesurer la densité optique (Do) de la solution à 664 nm
En déduire la concentration réelle de la solution (équation de Beer-Lambert):
Équation 7:Equation de Beer-Lambert.
𝑫𝒐 = 𝛆. 𝐋. 𝐂
ε : coefficient d’absorption spécifique = 87,67 ;
L : Longueur du trajet optique en cm ;
C : Concentration en g/l ;
Diluer alors cette solution afin d’obtenir une Do inférieure ou égale à 0,02. C’est la condition
nécessaire pour que la relation entre la concentration et la fluorescence soit toujours linéaire.