DEUXIÉME CHAPITRE: MATERIELS ET MÉTHODES
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5.1. Préparation de la fraction s9 :
- Apres le détachement des bivalves de leurs coquilles pour les mesures biométriques on
les conserve dans du papier aluminium à -21 °C
- Les glandes digestives sont prélevées et pesées
- 1g de glandes digestives est pris et ajouter à 10 ml de tampon ph7 (obtenu comme
suit : 24.4g dihydrogène phosphate de potassium KH2PO4 + 25.8g dihydrogène
phosphate de sodium et on y ajoute de l’eau distillé jusqu’à 1000ml)
- Le tout a été broyé et homogénéisé à l’aide d’un broyeur moulix 1000w
- L’homogénat obtenu a été centrifugé à 9000tr/min pendant 20min à 4 °C
- Le surnageant (s9) a été ensuite récupéré (il contient le cytosol, le réticulum
endoplasmique, l’appareil de golgi et les protéines cytosoliques) pour le dosage des
protéines et de l’activité catalase recherchée
5.2. Détermination des protéines
L’activité spécifique d’une enzyme et toujours exprimée par rapport une quantité de la
protéine, pour cette raison il nous a fallu doser la quantité des protéines au niveau de notre
échantillon afin de déterminer la concentration des protéines au niveau de notre échantillon,
La quantité de la protéine présente dans la solution s9 est déterminée selon la méthode de
Bradford 1976 en utilisant le bleu de coomassie comme réactif. Ce dernier réagit avec la
protéine en donnant des complexes de couleur bleu qui absorbent la lumière a une longueur
d’onde de 595nm, l’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de protéine
présente dans l’échantillon La détermination de la quantité de protéine est faite par dosage
chlorométrique basé sur le changement d’absorbance. (La couleur bleu résulte de l’interaction
des groupements anioniques du colorant avec les groupements aminés des protéines).
Preparation du réactif:
- 25ml d’Orthophosphate
- 50ml d’ethanol absolu
- 50mg bleu de coomassie (G250, Mreck)
- 425ml d’eau distiller
La couleur bleu doit disparaitre après ajout d’eau, le produit final à une couleur gris-brun
La solution préparée doit être filtrée et conservée dans l’obscurité à 4°c
La gamme étalon a été réalisée avec de l’albumine bovine sérique comme protéine standard a
des concentrations
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5.1. Préparation de la fraction s9 :
- Apres le détachement des bivalves de leurs coquilles pour les mesures biométriques on
les conserve dans du papier aluminium à -21 °C
- Les glandes digestives sont prélevées et pesées
- 1g de glandes digestives est pris et ajouter à 10 ml de tampon ph7 (obtenu comme
suit : 24.4g dihydrogène phosphate de potassium KH2PO4 + 25.8g dihydrogène
phosphate de sodium et on y ajoute de l’eau distillé jusqu’à 1000ml)
- Le tout a été broyé et homogénéisé à l’aide d’un broyeur moulix 1000w
- L’homogénat obtenu a été centrifugé à 9000tr/min pendant 20min à 4 °C
- Le surnageant (s9) a été ensuite récupéré (il contient le cytosol, le réticulum
endoplasmique, l’appareil de golgi et les protéines cytosoliques) pour le dosage des
protéines et de l’activité catalase recherchée
5.2. Détermination des protéines
L’activité spécifique d’une enzyme et toujours exprimée par rapport une quantité de la
protéine, pour cette raison il nous a fallu doser la quantité des protéines au niveau de notre
échantillon afin de déterminer la concentration des protéines au niveau de notre échantillon,
La quantité de la protéine présente dans la solution s9 est déterminée selon la méthode de
Bradford 1976 en utilisant le bleu de coomassie comme réactif. Ce dernier réagit avec la
protéine en donnant des complexes de couleur bleu qui absorbent la lumière a une longueur
d’onde de 595nm, l’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de protéine
présente dans l’échantillon La détermination de la quantité de protéine est faite par dosage
chlorométrique basé sur le changement d’absorbance. (La couleur bleu résulte de l’interaction
des groupements anioniques du colorant avec les groupements aminés des protéines).
Preparation du réactif:
- 25ml d’Orthophosphate
- 50ml d’ethanol absolu
- 50mg bleu de coomassie (G250, Mreck)
- 425ml d’eau distiller
La couleur bleu doit disparaitre après ajout d’eau, le produit final à une couleur gris-brun
La solution préparée doit être filtrée et conservée dans l’obscurité à 4°c
La gamme étalon a été réalisée avec de l’albumine bovine sérique comme protéine standard a
des concentrations