Chapitre II
Matériel et méthodes
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II.3.3.4. Techniques de caractérisation et d’identification de quelques bactéries
C’est un test qui permet la distinction entre deux groupes bactériens, les Gram + et les Gram -. Le
mécanisme de cette coloration est connu. Le violet de gentiane se fixe sur des composants
cytoplasmiques et après un temps de coloration, toutes les bactéries sont violettes. Chez les
bactéries à Gram négatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mélange alcool +
acétone) qui décolore le cytoplasme alors que, chez les bactéries à Gram positif, la paroi constitue
une barrière imperméable à l'alcool et le cytoplasme demeure coloré en violet.
a- Protocole de la coloration de Gram
Un frottis fixé à la chaleur et coloré pendant une minute avec une solution de violet de gentiane,
le frottis coloré est rincé rapidement avec une solution iodo-ioduré de Lugol, et il y est maintenu
pendant une minute. Le frottis est ensuite décoloré avec l’alcool à 95 % pendant quelques secondes
jusqu'à élimination de l’excès du colorant puis rincé immédiatement avec l’eau du robinet. Le frottis
est ensuite traité avec un colorant qui est une solution de Fushine, rincé rapidement au robinet et
séché. Après ce traitement, les cellules Gram négatif apparaissent roses et les cellules Gram positif
apparaissent sous une couleur violette (Singleton et Sainsbury, 1984)
b- Test de la catalase
Cette enzyme catalyse la décomposition du peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2 ) qui est produit par
certaines réactions cellulaires et est très toxiques, donc c’est l’une des enzymes chargée d’éponger
l’eau oxygénée par la dismutation (Pelmont, 1993). La réaction catalysée est la suivante :
2H 2 O 2
O 2 + 2H 2 O
Le test de la catalase consiste essentiellement à ajouter du peroxyde d’hydrogène à des bactéries : la
présence de catalase donne lieu à l’apparition de bulles d’oxygène.
c- Test d’oxydase
Ce test est réalisé à l’aide d’une plaque de marque « BD BBL Dryslide » contenant quatre petits
carrés pré-imprégné par un réactif et destiné chacun à tester une colonie bactérienne.
- Ecraser, avec une effilure d’une pipette Pasteur, une colonie de germe à étudier sur le petit
carré. S’il y a apparition d’une tache violette au bout de 30 secondes, on pourra conclure que
la bactérie est et qu’elle possède la cytochrome oxydase, dans le cas contraire la bactérie est
oxydase - .
d- Identification par la méthode des galeries API
Les galeries Api utilisent 20 tests : Etude de la fermentation de divers glucides, recherche directe
d'un enzyme. Chaque microtubule contient un substrat différent sur lequel le micro-organisme
considéré va réagir. Ils sont remplis d'une suspension bactérienne calibrée. Différentes galeries API
ont été utilisées pour l’identification des différents germes à titre d’exemple : API 20 STREP pour
les streptocoques, API20 STAPH pour les staphylocoques, API20 A pour les anaérobies
et API 20 E pour les entérobactéries dont les coliformes et salmonelles et qui peut être utilisée pour
l’identification des non entérobactéries (Vibrio, Pseudomonas). Le mode opératoire détaillé est
consigné en annexe II.
oxydase +
oxydase -
oxydase +