Chapitre 2
Matériels & Méthodes
72
2.5.2.7.6. Dénombrement des Clostridium sulfito-réducteurs
Le groupe des anaérobies sulfito-réducteurs regroupe différentes bactéries se multipliant
en l’absence d’air. Elles peuvent être considérées comme des germes fécaux ; ce sont aussi
des germes telluriques, et de ce fait, aucune spécificité d’origine fécale ne peut être attribuée à
leur mise en évidence. Dans une telle optique d’interprétation, il y a intérêt à ne chercher que
les espèces les plus susceptibles d’être fécales, c’est le cas en particulier de Clostridium
perfringens (RODIER et al, 1996). Les Clostridium perfringens sont des bâtonnets
anaérobies, Gram(+), sporulants et qui réduisent les sulfites en sulfures en 24 à 48 heures
(OMS, 1979).
Ils sont excrétés par l’homme et les animaux, on les trouve régulièrement dans
les matières fécales humaines, leur densité est la suivante (OMS, 1979) :
Excréments humains 106 à 108 /g ;
Eaux usées non traitées 103 /ml.
Ils sont employés comme indicateurs dans l’étude des pollutions littorales pour
un certain nombre de raisons (OMS, 1979) :
Ils se trouvent en abondance dans les eaux usées qui sont principalement d’origine
humaine ;
Ils ne se multiplient pas dans les sédiments ;
Ils survivent longtemps dans les sédiments, ce qui permet de déceler
une pollution ancienne ou intermittente (RODIER et al, 1996).
A- Principe :
Les microorganismes sulfito-réducteurs réduisent le sulfite de sodium en sulfure,
provoquant avec le citrate ferrique un précipité noir de sulfure de fer autour des colonies.
Pour effectuer le dénombrement des Clostridium perfringens, il est recommandé
d’incuber l’échantillon à 37°C pendant 24 à 48 heures avec le milieu VF+ additifs (versé
dessus) et de procéder ensuite à la confirmation des colonies caractéristiques.
B- Mode opératoire :
Après régénération de la gélose viande foie (VF) par ébullition au bain-marie, ajouter
une ampoule d’Alun de fer et une autre de sulfite de sodium (Additifs) à 250 ml de gélose ;
Préparer 4 tubes contenants de 1 à 5 ml de solution mère et les maintenir à 80°C au bain
Marie pendant 5 à 10 minutes puis les refroidir brusquement sous l’eau du robinet ;
Ajouter de 15 à19 ml de la gélose VF + Additifs à l’aide d’une pipette stérilisée ;
Incuber les tubes à 37°C pendant 24 heures.
Les résultats sont directement obtenus par le comptage des spores qui ont germé. Ils
sont exprimés en (spores / 20 ml).
La figure ci-après résume la manipulation.
Matériels & Méthodes
72
2.5.2.7.6. Dénombrement des Clostridium sulfito-réducteurs
Le groupe des anaérobies sulfito-réducteurs regroupe différentes bactéries se multipliant
en l’absence d’air. Elles peuvent être considérées comme des germes fécaux ; ce sont aussi
des germes telluriques, et de ce fait, aucune spécificité d’origine fécale ne peut être attribuée à
leur mise en évidence. Dans une telle optique d’interprétation, il y a intérêt à ne chercher que
les espèces les plus susceptibles d’être fécales, c’est le cas en particulier de Clostridium
perfringens (RODIER et al, 1996). Les Clostridium perfringens sont des bâtonnets
anaérobies, Gram(+), sporulants et qui réduisent les sulfites en sulfures en 24 à 48 heures
(OMS, 1979).
Ils sont excrétés par l’homme et les animaux, on les trouve régulièrement dans
les matières fécales humaines, leur densité est la suivante (OMS, 1979) :
Excréments humains 106 à 108 /g ;
Eaux usées non traitées 103 /ml.
Ils sont employés comme indicateurs dans l’étude des pollutions littorales pour
un certain nombre de raisons (OMS, 1979) :
Ils se trouvent en abondance dans les eaux usées qui sont principalement d’origine
humaine ;
Ils ne se multiplient pas dans les sédiments ;
Ils survivent longtemps dans les sédiments, ce qui permet de déceler
une pollution ancienne ou intermittente (RODIER et al, 1996).
A- Principe :
Les microorganismes sulfito-réducteurs réduisent le sulfite de sodium en sulfure,
provoquant avec le citrate ferrique un précipité noir de sulfure de fer autour des colonies.
Pour effectuer le dénombrement des Clostridium perfringens, il est recommandé
d’incuber l’échantillon à 37°C pendant 24 à 48 heures avec le milieu VF+ additifs (versé
dessus) et de procéder ensuite à la confirmation des colonies caractéristiques.
B- Mode opératoire :
Après régénération de la gélose viande foie (VF) par ébullition au bain-marie, ajouter
une ampoule d’Alun de fer et une autre de sulfite de sodium (Additifs) à 250 ml de gélose ;
Préparer 4 tubes contenants de 1 à 5 ml de solution mère et les maintenir à 80°C au bain
Marie pendant 5 à 10 minutes puis les refroidir brusquement sous l’eau du robinet ;
Ajouter de 15 à19 ml de la gélose VF + Additifs à l’aide d’une pipette stérilisée ;
Incuber les tubes à 37°C pendant 24 heures.
Les résultats sont directement obtenus par le comptage des spores qui ont germé. Ils
sont exprimés en (spores / 20 ml).
La figure ci-après résume la manipulation.